第三军医大学学报1999年第21卷第2期

肖华亮王东李增鹏陈俐

提要目的：探讨骨肉瘤组织蛋白酶D表达与肿瘤细胞增殖活性及骨肉瘤预后的关系。方法：运用免疫组织化学染色，检测85例骨肉瘤细胞增核抗原(PCNA)及组织蛋白酶D(Cath-D)的表达，计算其标记指数(Labelling index即LI)。结果：Cath-D LI在6%～98.5%之间，PCNA LI在9%～98%之间，Cath-D LI与骨肉瘤患者的年龄、性别、肿瘤的大小及Dahilin分型无关，而与WHO1993年新分型，Price分级及PCNA LI密切相关。生存率分析显示Cath-D LI＜62.5%的骨肉瘤预后较好，＞62.5%的骨肉瘤预后较差。结论：骨肉瘤Cath-D表达与肿瘤细胞增殖活性及生存率密切相关，提示Cath-D LI可能是评估骨肉瘤预后的一项有价值的指标。

关键词：骨肉瘤组织蛋白酶D免疫组织化学预后

骨肉瘤是严重危害青少年健康的恶性肿瘤之一。大量研究表明，组织蛋白酶D(Cathepsin D,Cath-D)在乳腺癌^［1］、胃癌、卵巢癌、喉癌、甲状腺癌、黑色素瘤等的侵袭、转移乃至预后中有一定程度的关系，但与骨肉瘤转移和预后关系怎样，目前尚未见报道。本研究应用免疫组织化学染色方法，检测85例骨肉瘤Cath-D的表达，旨在探讨Cath-D表达与骨肉瘤细胞增殖活性及预后的关系。

1材料与方法

1.1临床资料

1968～1993年间长骨中央型骨肉瘤85例，男性57例，女性28例，男女比约为2∶1，患者年龄11～55岁，平均21.5岁。其中手术切除标本81例，活检4例。全部病例均有随访，随访时间5～25年。

1.2免疫组化染色

标本均经10%福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋切片，所用增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体及Cath-D多克隆抗体均为DAKO公司产品，ABC法进行免疫组化染色。Cath-D染色时于加一抗前用胰酶消化20 min，以PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.3结果判定方法

选择切片中典型的骨肉瘤组织学图像，高倍镜下观察500个肿瘤细胞，计数其中PCNA及Cath-D阳性细胞数。PCNA标记指数(Labelling index,LI)=PCNA阳性细胞数/所观察的肿瘤细胞数×100%；Cath-D LI=Cath-D阳性细胞数/观察的肿瘤细胞数×100%。指据Cath-D LI将Cath-D标记结果分为0～3级:0级阴性(＜10%)；Ⅰ级(10%～30%)；Ⅱ级(30%～66%)；Ⅲ级(＞66%阳性)。

1.4统计学分析方法

Cath-D表达与骨肉瘤临床病理的关系，应用Pearson χ²检验进行统计学分析，Cath-D LI与PCNA LI相关性采用Spearman秩和相关检验。以中位数将Cath-D染色结果分为高表达及低表达两组，统计两组骨肉瘤存活期，并行Log-rank检验。

2结果

2.1临床病理资料

肿瘤直径5～20 cm，平均约10.5 cm。组织学分级采用Price三级法，组织学分型采用1993年WHO新分型^［2］有Dahlin分型两种，以作比较。随访5～25年，平均生存期为26个月，两年生存率约为51.8%，5年生存率仅为23.4%。

2.2免疫组化染色结果

PCNA的表达呈颗粒状阳性，定位于细胞核。骨肉瘤中骨母细胞、纤维母细胞、软骨母细胞、小圆型细胞和多核瘤巨细胞对PCNA均呈阳性反应。PCNA LI在9%～98%之间，平均指数为54.5%。随着骨肉瘤分化程度的不同，PCNA阳性表达亦呈显著异质性，见图1、2。

图1低分化骨肉瘤示PCNA高表达(ABC×200)

Fig 1High-grade expression of PCNA in poor-differentiated osteosarcoma(ABC×200)

图2高分化骨肉瘤示PCNA较低表达(ABC×200)

Fig 2Low-grade expression of PCNA in well-differentiated osteosarcoma(ABC×200)

Cath-D阳性表达定位于细胞浆，呈棕褐色细或粗颗粒状，可见于骨肉瘤中各种肿瘤细胞。Cath-D表达具有一定异质性，在瘤细胞及骨样组织分化成熟的区域，Cath-D表达多为散在弱阳性，而在低分化区域，Cath-D多为弥漫的强阳性。此外，在肿瘤间质中部分炎症细胞及肿瘤微血管内皮细胞可见Cath-D强阳性表达，见图3、4。85例标本中阴性(＜10%)2例，Ⅰ级(＜30%)10例，Ⅱ级(30%～66%)29例，Ⅲ级(＞66%)44例。Cath-D LI在6%～98.5%之间，平均指数为56.2%，其中位数为62.5%。

图3低分化骨肉瘤示Cath-D弥漫阳性表达(ABC×200)

Fig 3Tumor cells show diffuse staining of cathepsin D in poor-differentiated osteosarcoma(ABC×200)

图4高分化骨肉瘤示Cath-D散在阳性表达(ABC×200)

Fig 4It showed the expression of cathepsin D in well-differentiated osteosarcoma in a single pattern(ABC×200)

2.3骨肉瘤Cath-D指数与肿瘤临床病理的关系

Cath-D高表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小及Dahlin分型无关，PriceⅢ级的Cath-D表达明显高于Price Ⅰ级及Ⅱ级(P＜0.01)，WHO新分型中普通型的Cath-D表达明显高于高分化型，二者相差非常显著(P＜0.01)。

2.4肿瘤Cath-D表达与瘤细胞增殖活性之间的关系

结果显示，瘤细胞PCNA高表达者其Cath-D也大都显示为高表达，经行Spearman秩和相关检验，等级相关系数r_s=0.425(P＜0.01)，提示Cath-D LI与PCNA LI之间存在显著正相关。

2.5肿瘤Cath-D水平与预后的关系

以Cath-D LI中位数62.5%将85例标本分为高表达组及低表达组，统计两组的存活期，并行Log-rank检验，χ²=6.42,P＜0.025，两者相差显著，Cath-D高表达组骨肉瘤患者的生存期较低表达组显著缩短。

3讨论

骨肉瘤是骨的最常见的原发性恶性肿瘤，其发病率占恶性骨肿瘤的21%左右，好发于青少年，本组资料平均年龄为21.5岁，最高峰段16～19岁，占55%。骨肉瘤恶性度高，危害性大，其致死率及因截肢造成的致残率均较高，近年来，随着诊治手段的不断改进，其存活率有所提高，国外报道其5年存活率在40%～50%之间，本组病例5年生存率仅为23.4%。早期经血道发生远处转移是其预后不良的主要原因之一，探讨其转移机制，研究转移过程中的各种影响因素，并获得一种能较准确评价其预后的指标，是骨肉瘤病理研究中的一个重要问题。

恶性肿瘤的侵袭、转移是一个相当复杂的过程。瘤细胞自脱离原瘤灶到转移灶的形成，至少应两次穿越血管壁并向周围组织侵袭，在此过程中，蛋白水解酶包括胶原酶、血纤溶酶原激活剂、组织蛋白酶等可能起着极为重要的作用。

Cath-D是一种嗜酸性溶酶体蛋白水解酶，广泛存在于人体各种组织和细胞中，现已能自体外培养的乳腺癌细胞中产生，它具有多种分子量形式，最初为52×10³u的前体蛋白，然后在溶酶体内加工成为48×10³u的中间体，最后转变为分子量34×10³u及14×10³u的成熟形式^［3］。Cath-D作为一种蛋白水解酶，可以直接催化细胞外基质的降解，并间接破坏血管基膜；它还可以激活组织蛋白酶B，从而触发链式反应，诱导产生活化的尿激酶型-血纤溶酶原激活剂(u-PA)^［4］，而组织蛋白酶B、u-PA均被认为是与恶性肿瘤侵袭、转移密切相关的蛋白水解酶；此外，Cath-D也参与肿瘤细胞的有丝分裂活动^［5］，这也是其影响肿瘤转移的可能机制之一。

目前Cath-D免疫组化已广泛应用于乳腺癌、胃肠道癌、卵癌、喉癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤等的研究中，发现Cath-D表达与这些肿瘤的侵袭、转移、预后有不同程度的关系，其中以与乳腺癌的关系研究最为深入，研究表明，Cath-D免疫组化染色，可作为乳腺癌，尤其是Ⅰ期乳腺癌判断预后的一个独立指标。1995年Aaltonen^［1］报道了151例乳腺癌，其中Cath-D高表达组生存率明显低于低表达组；Garcia用Cath-D转染细胞，不仅观察到其可以使细胞转化，增加恶性表型，而且其过度表达与侵袭转移有关^［6］。1996年Gohring研究发现Cath-D表达可作为判断无淋巴结转移乳腺癌患者预后不良的标志^［7］；另有研究证实，Cath-D间质细胞表达对于判断乳腺癌复发及预后的意义远远高于肿瘤细胞表达^［8］。在其肿瘤，如胃癌、结肠癌、膀胱癌、前<