第二军医大学学报1999年第3期

周斌张俊平胡振林钱定华

摘要目的：研究蛋白激酶C（PKC）抑制剂对纤维蛋白原降解产物（FFDP）引起的大鼠主动脉血管内皮细胞（RAEC）损伤的保护作用和平滑肌细胞（RASMC）增殖的抑制作用。方法：RAEC损伤以乳酸脱氢酶释放测定，RASMC增殖以结晶紫染色法测定。结果：FFDP能促进RAEC释放乳酸脱氢酶，诱导RASMC增殖；PKC抑制剂槲皮素、Ro 31-8220剂量依赖性地抑制FFDP对RAEC的损伤，并抑制FFDP诱导的RASMC增殖。结论：PKC抑制剂对FFDP引起的RAEC有保护作用，对RASMC增殖有抑制作用。

关键词：纤维蛋白纤维蛋白原降解物 蛋白激酶抑制剂 平滑肌细胞 内皮

近年来的流行病学研究表明，高水平血浆纤维蛋白原是一重要、独立的心脑血管疾病危险因素^［1］。纤维蛋白原降解相关肽大量存在于动脉粥样硬化斑块中，纤维蛋白原降解产物(FFDP)可能通过与构成斑块的多种细胞相互作用而参与了动脉粥样硬化发生发展的全过程。因此，研究FFDP作用的机制，并寻找有效保护药物，对动脉粥样硬化的防治具有重要意义。本研究利用体外培养的大鼠主动脉内皮细胞（RAEC）和大鼠主动脉平滑肌细胞（RASMC），观察FFDP对RAEC损伤、RASMC增殖的作用及蛋白激酶C（PKC）抑制剂槲皮素、Ro 31-8220对上述作用的影响。

1材料和方法

1.1试剂与动物纤维蛋白原、纤维蛋白、纤溶酶、抑肽酶、槲皮素：美国Sigma公司产品；Ro 31-8220由英国Roche研究中心David Bradshaw博士馈赠。SD大鼠，体质量200～220g，由本校实验动物中心提供，雌雄不限。

1.2FFDP的制备按文献［2］方法进行，纤溶酶消化时间为6h。

1.3RAEC，RASMC的培养按文献[3]、[4]方法进行。

1.4FFDP对RAEC的损伤及药物的保护作用取3～5代已长成致密单层的RAEC，1×10⁵个/孔接种于24孔细胞培养板(10% NCS)，孵育48h后倾去培养基，用D-Hank液荡洗2次，加入含FFDP的无血清培养基孵育，给药组同时加入药物；终体积为0.5ml。在细胞贴壁完好的情况下，分别取其细胞上清和用0.2% TritonX-100破膜后的细胞溶解液，按文献［5］方法测定乳酸脱氢酶(LDH)活性，计算LDH释放率。

1.5FFDP对RASMC的促增殖作用和药物的抑制作用取3～5代已长成致密单层的RASMC，1×10⁴个/孔接种于96孔细胞培养板(10% NCS)，孵育24h后倾去上清，D-Hank液洗2遍，换入含FFDP的无血清培养基孵育。观察药物作用时将药物与FFDP同时加入共同孵育。细胞的增殖按我室参照Gillies等方法建立的结晶紫染色法于595nm处测定光密度。

1.6统计学处理数据以±s表示，采用t检验。

2结果

2.1槲皮素、Ro 31-8220对FFDP促进RAEC释放LDH的抑制作用FFDP(2mg/ml)与RAEC共同孵育，16 h后即可使RAEC的LDH释放率显著升高[(8.58±0.43)%vs 对照(3.06±0.32)%, P＜0.01]；FFDP较高剂量(5mg/ml)与RAEC孵育24 h后，镜下还可见有部分贴壁细胞剥脱悬浮。槲皮素、Ro 31-8220均能剂量依赖性地抑制FFDP诱导的LDH释放率升高。槲皮素5，10，20μmol/L分别使FFDP（2mg/ml）诱导RAEC的LDH释放率分别降至(7.04±0.90)%，(6.20±1.06)%(P＜0.05)，(5.30±0.48)% (P＜0.01 )；Ro 31-8220 0.01，0.1，1μmol/L则能使LDH释放率降至(6.88±0.77)% (P＜0.05)，(5.89±0.69)% (P＜0.01)，(4.84±0.60)% (P＜0.01)。

2.2槲皮素、Ro 31-8220对FFDP诱导RASMC增殖的抑制作用FFDP(1mg/ml)与RASMC共同孵育24 h能显著促进RASMC增殖 [(0.36±0.03)vs对照(0.18±0.03), P＜0.01]。槲皮素、Ro 31-8220能显著抑制FFDP诱导的RASMC增殖。槲皮素10，20，40μmol/L使FFDP（1mg/ml）诱导的RASMC增殖降至(0.31±0.03)，(0.29±0.04) (P＜0.05)，(0.26±0.05) (P＜0.05)；Ro 31-8220的0.01,0.1,1μmol/L则能抑制RASMC增殖降至(0.33±0.03),(0.30±0.03) (P＜0.05),(0.23±0.03) (P＜0.01)。

3讨论

血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化形成的始动因素，平滑肌细胞增殖是动脉粥样硬化形成的关键步骤。本研究证明，FFDP对培养的RAEC有明显损伤作用，并能诱导RASMC增殖。因此，使用药物有效抑制FFDP对内皮细胞、平滑肌细胞的作用，是防治动脉粥样硬化等心脑血管疾病的重要途径。

PKC是目前发现的最大的Ser/Thr蛋白激酶家族，广泛分布于各种动物的组织中，在细胞跨膜信号传导中起重要作用，包括平滑肌细胞分化和增殖等。槲皮素为植物中提取的黄酮成分，是一种有效的PKC抑制剂，本室前期研究发现它对TNF所致内皮细胞损伤有保护作用^［6］；Ro 31-8220^［7］则是近年Roche公司合成的一种高选择性新型PKC抑制剂，其IC₅₀为10nmol/L。本研究表明，槲皮素、Ro 31-8220均能有效抑制FFDP诱导的RAEC损伤、RASMC增殖，提示PKC在FFDP作用的信号传导中起重要作用；抑制FFDP的作用是PKC抑制剂运用于心血管疾病防治的机制之一。

国家自然科学基金资助项目,批准号39370798

作者单位：周斌胡振林钱定华第二军医大学药学院理学教研室,上海,200433

张俊平第二军医大学药学院生化药学教研室

周斌，男,1969年9月生,硕士,讲师

参 考 文 献

[1]Ernst E. Fibrinogen: an important risk factor for atherothrombotic diseases. Ann Med,1994, 26(1):15

[2]Lorenzet R, Sobel JH, Bini A, et al. Low molecular weigh fibrinogen degration products stimulate the release of grow factors from endothelial cells. Thromb Haemost, 1992, 68(3):357

[3]颜培华，李凤芝. 大鼠主动脉内皮细胞培养及鉴定方法. 军事医学科学院院刊，1993,17(2):124

[4]Haller H, Lindschau C, Quass P, et al. Differentiation of vascular smooth muscle cells and the regulation of protein kinase C-α. Circ Res, 1995,76(1):21

[5]孟泽，朱忠勇. 酶及激素的测定. 见：朱忠勇 主编. 实用医学检验学. 北京：人民军医出版社，1992. 329～332

[6]余祥斌，刘锡钧，钱定华，等. 肿瘤坏死因子对牛肺动脉内皮细胞的损伤及蛋白激酶C抑制剂的抑制作用. 药学学报, 1996, 31(3):176

[7]Davis PD, Elliott LH, Harris W, et al. Inhibitors of protein kinase C.2. Substituted bisindolylmaleimides with improved potency and selectivity. J Med Chem, 1992, 35(6):994