【 摘要 】目的探讨含BPV(牛乳头状瘤病毒)L1/HPV(人乳头状瘤病毒)16E7嵌合型乳头状瘤病毒样颗粒(VLPs)的免疫学特性。方法将表达纯化的含BPVL1/HPV16E7的嵌合型VLPs作为抗原在体外刺激EL-4细胞并对其进行细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应分析。结果嵌合型VLPs可引发特异的CTL反应。L1-VLPs抗体能阻断这种特异性细胞溶解反应。结论含BPVL1/HPV16E7嵌合型的VLPs能作为抗原引发特异性的细胞溶解反应。试验结果可能有利于研制HPV的嵌合型VLP疫苗。

The chimeric BPVL1/HPV16E7 virus-like particles induced CTL

CHENG Hao, ZHENG Shu, LIU Xiao

(song, et al. Department of Dermatology, Sir Run Shaw Hospital of Zhejiang University, Hangzhou 310016, P.R. China)

【 Abstract 】ObjectiveTo study the immunogenesis of chimeric BPVL1/HPV16E7 virus-like particles (VLPs).MethodsThe in vitro cytotoxic T lymphocyte (CTL) assay was applied to characterize the antigen presenting procedure of this chimeric VLPs in EL-4 cell.ResultsThe chimeric VLPs could be processed in EL-4 cells which then induced specific cell lysis by CTL. The antibody against L1-VLPs blocked the specific cell lysis.ConclusionThe chimeric BPVL1/HPV16E7 VLPs, were endocytosed after binding to its receptor on EL-4 cell membrane, and then transported, digested, and presented CTL epitope. As a result, the specific cellular immunity was induced in vitro. The results suggested a potentiality of utilizing HPV16E7 as a vaccine.

【 Subject words 】HPV16E7; Virus-like particles; Cytotoxic T lymphocyte

人类乳头状瘤病毒(HPV)16型早期蛋白E7被证实不仅对细胞恶性转化和维持恶性过程起着关键作用^〔1,2〕，而且还是肿瘤排斥抗原^〔3〕。因此，阻止肿瘤形成的E7疫苗已成为近年研究热点。本实验使表达和纯化的含晚期结构基因和早期基因的BPVL1/HPV16E7嵌合型病毒样颗粒VLPs作为抗原在EL-4细胞得到呈递，并引发细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。

材料和方法

细胞、菌株、质粒、试剂和动物：EL-4细胞（小鼠胸腺瘤细胞株）、C2细胞(HPV16E7基因转染的EL-4细胞)、大肠杆菌DH5α、昆虫细胞(Sf9)、质粒pUC(含有BPVL1)、质粒pVL1393、HPV16晚期结构基因L1单抗(MC15)以及HPV16E7(a)和(b)单抗等均由澳大利亚昆士兰大学免疫和癌症研究中心(CICR)提供。EL-4细胞和C2细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养。Sf9细胞的培养基为含10%胎牛血清的Sf-900Ⅱ培养基(GIBCO, BRL, USA)。杆状病毒和Baculo Gold^TM转染药盒购于美国Pharmingen公司。EcoRⅤ、BamHⅠ、XbaⅠ、NgoMⅠ、T4 DNA连接酶和限制性内切酶缓冲液等购于美国Promega公司。DNA提取药盒购于美国QIAGEN公司。增强化学发光法(enhanced chemiluminescence, ECL)药盒购于澳大利亚Amersham公司。雌性4～6周龄小鼠C57BL/6J由澳大利亚动物资源中心提供。

BPVL1/HPV16E7重组体的构建、表达和纯化鉴定：参照文献〔4,5〕。

聚合酶链反应(PCR)：HPV16E7基因被分成3段进行PCR扩增。3对引物分别为：E7(a), 5′-ATG

GATATCATGCATGGAGATACACCTACATTGC-3′和5′-C

ATGGATATCCGGCCGTTATGAGCTGTCATTTAATTGC-3′；E7(b), 5′-TATGGATATCGAGGAGGAGGATGATGAA

ATAGATGGTCC-3′和5′-CATGGATATCCGGCCGTTACC

TAGAGTCACACTTGCAACAAAAGG-3′；E7(c), 5′-ATG

GATATCCTTCGGTTGTGCGTACAAAGC-3′和5′-GATAT

CCGGCCGTTATGGTTTCTGAGACCAGA-3′。

基因克隆：乳头状瘤病毒的晚期结构基因L1的C末端不为形成病毒样颗粒所必须，而可切除部分片段并融合其它基因片段，其表达的重组蛋白也并不因此而降低其形成VLPs的能力。利用此特性我们将3段HPV16E7(a)、E7(b)和E7(c)的PCR扩增产物经EcoRⅤ酶切后克隆入连接有BPVL1的载体pUC，并用XbaⅠ和NgoMⅠ酶切筛选正确连接克隆。将3段BPV L1-HPV16E7分别经BamHⅠ酶切后插入杆状病毒转染质粒pVL1393(图1)，XbaⅠ酶切筛选正确连接克隆。3株重组克隆分别命名为pVL1393/BPV L1-HPV16E7(a)、pVL1393/BPV L1-HPV16E7(b)和pVL1393/BPV L1-HPV16E7(c)。

图1构建pVL1393-BPVL1/HPV16E7的转染质粒示意图

Fig 1. Construction of pVL1393-BPVL1/HPV16E7 transfer vector

转染杆状病毒：用Baculo Gold^TM转染药盒将pVL1393/BPVL1-HPV16E7转染杆状病毒线状DNA并感染Sf9的昆虫细胞，27℃培养约72 h即生成VLPs。

重组杆状病毒的表达和纯化：上述昆虫细胞培养液经离心、沉淀重悬于PMSF-PBS、冰浴上匀浆器碾磨、超声裂解、20%蔗糖及5%氯化铯4℃超离心、收集浮密度为1.30g/ml的白色条带(含重组蛋白VLPs)。

重组蛋白的鉴定：重组蛋白经10% SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色和Western blot分析。后者转膜后用BPVL1单抗MC15(1∶2 000)和HPV16E7单抗(1∶1 000)杂交、ECL法显示杂交条带。另将样本进行透射电镜观察。

CTL反应

靶细胞的标记：靶细胞为C2细胞和EL-4细胞2种。加100μCi ⁵¹Cr标记细胞。

效应细胞的制备：在C57 BL/6J小鼠尾根部免疫接种100μg的HPV16E7寡肽(RAHYNIFTF，HPV16E7第49～57位氨基酸）。21 d后取接种鼠脾细胞并同时取裸鼠脾细胞作为抗原呈递细胞(APC)；培养第4～7天作为效应细胞用于CTL测定。

用VLPs刺激靶细胞：3种嵌合型BPVL1-HPV16E7 (a)、(b)和(c) VLPs分别与上述⁵¹Cr标记的C2细胞和EL-4细胞孵育3 h（浓度为50μg VLPs/10⁶细胞）。作为对照将靶细胞与BPV1L1-VLPs抗体(1∶1 000)和无关抗体(抗兔抗体1∶1 000)孵育1 h后再与3种嵌合型 VLPs孵育3 h。

CTL反应测定：分别加100μl效应细胞和靶细胞于圆底96孔板，效应细胞/靶细胞比例(E∶T ratio)调至5∶1、2.5∶1、0.1∶1，每份样本重复3孔；37℃ 5%CO₂孵育5 h后每孔收集100μl上清液；γ计数仪测定同位素释放量。靶细胞的特异性溶解百分率计算如下：

最大释放量为100μl靶细胞中加入100μl的10% SDS后的同位素释放量，自发释放量则为100μl靶细胞与100μl培养基孵育而得。

结果

1.含BPVL1/HPV16E7的VLPs的生成和鉴定：本实验成功克隆和表达了3段含BPVL1/HPV16E7(a)、(b)和(c)的嵌合型VLPs。在氯化铯梯度液中收得浮密度为1.30g/ml的可见条带，经SDS-PAGE分离后用考马斯亮蓝染色和Western blot证实，相对分子质量(M_r)为55×10³附近的条带均为特异的L1及HPV16E7(a)和(b)(图2)。透射电镜证实3种嵌合型VLPs均为形态和结构与野生型乳头状瘤病毒相同的50nm大小的环状颗粒结构(图3)。我们未能用E7(c)抗体鉴定BPVL1/HPV16E7(c)，但根据酶切、Western blot、考马斯亮蓝染色和电镜结果我们推断得到了BPVL1/HPV16E7(c)。

2.嵌合型VLPs引发的体外CTL反应：与3种嵌合型BPV1L1/HPV16E7(a)、(b)和(c) VLPs分别孵育的靶细胞被效应细胞特异性溶解的情况见图4。与BPV1L1/HPV16E7 VLPs (b)孵育的EL-4细胞能被效应细胞特异杀伤，其特异性溶解率分别为43.1%(E∶T=5∶1)、7.5%(E∶T=2.5∶1)和4.5%(E∶T=0.1∶1)。BPV1L1/HPV16E7 VLPs (a)和(c)未能有效引发特异性细胞溶解反应。未接受VLPs刺激的EL-4细胞未能被效应细胞有效杀伤。C2细胞用作CTL测定的阳性对照，其特异性溶解率为91.3%(E∶T=5∶1)、52.4%(E∶T=2.5∶1)和25.1%(E∶T=0.1∶1)。与BPV1L1-VLPs抗体孵育1 h后再与3种嵌合型VLPs孵育的EL-4细胞不能被效应细胞有效杀伤。用无关抗体处理的EL-4细胞与 BPV1L1/HPV16E7 VLPs (b)孵育后其特异性溶解率仍有42.3% (E∶T=5∶1)、6.5%(E∶T=2.5∶1)、5.6%(E∶T=0.1∶1)。

图2Western blot嵌合型VLP用L1抗体杂交的ECL结果

Fig 2. BPVL1/HPV16E7 VLP Western blot probed with anti-BPVL1 developed with ECL

1: BPVL1/HPV16E7c; 2: BPVL1/HPV16E7b; 3: BPVL1/HPV16E7a; 4:BPVL1

图3含HPV16E7的嵌合型VLP电