【 摘要 】目的表达戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)ORF2 C端128个氨基酸残基的抗原片段ORF2.3，并进行其免疫学特性的研究。 方法用pBV220载体进行抗原的非融合表达，包涵体经变性凝胶过滤层析及离子交换层析纯化后透析复性，以Western blot、ELISA、动物免疫与抗原捕获RT-nPCR等方法研究其免疫学特性。 结果获得了ORF2.3的高效表达，表达量占菌体总蛋白50%左右，纯化后纯度达98%以上，Western blot表明表达抗原可与戊肝患者阳性血清特异性结合；在HEV感染恒河猴实验中用于IgG抗体的检测，具有较好灵敏度与特异性；用其免疫豚鼠，抗体经ELISA法测定效价为1∶8000；用制备的豚鼠抗血清捕获戊型肝炎病毒颗粒，经RT-nPCR扩增出特异性片段。 结论ORF2.3抗原片段具有HEV抗体识别的抗原表位，能够刺激机体产生抗体，抗血清具有一定的识别与结合戊型肝炎病毒颗粒的能力。

The expression and characterization of the C terminal fragment of HEV ORF2

MA Yanbing, SUN Maosheng, LI Hongjun, et al.

（Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Science and PUMC, Kunming 650118, P. R. China）

【Abstract】ObjectiveTo express and characterize the C terminal fragment of HEV ORF2. MethodsThe gene encoding C terminal 128 amino acid fragment of HEV ORF2 was inserted into nonfusion expression vector pBV220. The resultant pBVORF2.3 was transformed into E.coli strain DH5α. ResultsHigh level expression was achieved 4 hours after induction at 42℃. The recombinant protein, with molecular weight about 14000, was up to 50 percent of total protein and presented in inclusion bodies. The recombinant protein ORF2.3 was purified to near purity after denatured size exclusion chromatography and ionic exchange chromatography. It was recognized by serum from HEV positive patients and Macaque in Western blot assay. Furthermore, if induced antibodies in Guinea pig specific for HEV particles. ConclusionThe fragment ORF2.3 can be recognized by anti-HEV antibody, it can induce the production of antibody capable of recognizing HEV particles.

【Subject words】Hepatitis E virus; Antigen; Expression; Immunology characters

戊型肝炎(hepatitis E,HE)主要流行于发展中国家，1986～1988年我国新疆曾有过较大规模的暴发流行，戊肝诊断试剂与疫苗研究日益引起人们的重视。戊型肝炎病毒有墨西哥株、缅甸株、巴基斯坦株3个亚型，三者之间核苷酸与氨基酸序列具有高度同源性，病毒颗粒间具有极强的免疫交叉反应，因此，目前认为全球HEV同属于一个血清型。HEV基因组全长7.5kb，分为3个阅读框架，ORF1编码与病毒复制有关的功能性蛋白，ORF2与ORF3推测编码病毒的结构蛋白。研究者们通过对合成肽抗原及重组抗原的研究^〔1-6〕发现了多个抗原表位，研究表明，ORF2 C端集中了主要的抗原位点。重组抗原与合成肽抗原在ELISA方法检测HEV抗体中已初步用于临床诊断。由于HEV体外组织培养至今尚不成功，经典疫苗的研究还无法开展，因此基因工程疫苗的研制成为人们关注的焦点。Purdy等^〔7〕利用TrpE融合系统表达了HEV ORF2 C端440个氨基酸残基片段，并用于动物攻击保护实验，研究表明，该抗原刺激机体产生抗体，抗体具有保护机体免受不同亚型病毒攻击的能力。在本研究中，我们用pBV220载体完成了ORF2 C端128个氨基酸残基片段的非融合高效表达，并就其免疫学特性进行了研究。

材料与方法

质粒与菌种：含有HEV ORF2 3′端1.3kb基因片段的质粒pEHG2及表达载体pBV220分别为预防医学科学院病毒所毕胜利教授与张智清教授惠赠，受体菌DH5α为本室保存。

引物：参照毕胜利报道中国株序列^〔8〕，由上海生工生物工程公司合成。F1、R1为表达引物，5′引物F1引入酶切位点EcoRⅠ及起始密码子ATG，3′引物R1引入酶切位点PstⅠ及强终止密码TAA，F2、R2、F3、R3为RT-nPCR检测引物：F1(6743～6763)： CGGAATTCATGTCTAAGACCTTCTTTGTCCTG，R1(7126～7106)： GTCTGCAGTTATAACTCCCGAGTTTTACCCAC，F2(4458～4478)： TGCTATTATGGTGGAGTGTGG，R2(4876～4859)： CAGGGCCCCAATTCTTCT，F3(4520～4540)： CTGCGTGGATCCTGCAGGCCC，R3(4762～4741)： CCTTCAACTTCAGGCCACAGCC。

工具酶及其它：核酸内切酶为华美产品，AMV为Promega产品，Taq酶由上海生工生物工程公司提供，所用抗体为Sigma产品。

重组质粒构建：以pEHG2为模板，F1与R1为引物扩增出409bp片段，PCR条件为：94℃，1min，55℃，1min,72℃,1min,共30个循环，72℃延伸7min。扩增片段经EcoRⅠ与PstⅠ双酶切，接入pBV220载体(图1)。重组子转化受体菌DH5α。

图1pBVORF2.3重组质粒的构建

Fig 1. Construction of recombinant pBVORF2.3 vector

表达与纯化：温控诱导4h，离心收集菌体，超声破碎，包涵体经4mol/L尿素洗涤1次，1% Triton X-100洗涤2次后，溶于缓冲液A(8mol/L尿素，50mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA, 20mmol/L巯基乙醇，pH9.0)，经8mol/L尿素下Superdex-75凝胶柱及Q Sepharose阴离子柱纯化后，按0.1mg/ml蛋白浓度对缓冲液B(50mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA, pH9.0, 0.2mmol/L GSSG)透析过夜，浓缩后待用。

Western blot：按常规方法操作，样品为纯化的ORF2.3，12% SDS-PAGE后转至硝酸纤维膜进行杂交，实验组一抗为HE患者阳性血清，对照组一抗为正常阴性血清，二抗为羊抗人IgG-HRP。

ELISA：按常规方法操作进行，抗原按每孔2～4μg/100μl包被酶标板，实验组样品为HEV感染的恒河猴血清，对照组为实验对照猴血清，二抗为兔抗猴IgG,酶标抗体为羊抗兔IgG-HRP。

动物免疫：抗原加弗氏不完全佐剂，双侧腋下、腹股沟四点注射免疫豚鼠，每隔1周加强免疫1次，共2次，再过1周后心脏取血制备抗血清。以ELISA法测定，抗血清组A490接近或≥2.1倍正常血清组A490时，抗血清稀释度为其效价。

抗原捕获RT-nPCR：取180稀释的兔抗豚鼠IgG 200μl包被0.5ml小管，37℃，2h，PBS-T洗3次，500μl 5% BSA 37℃封闭2h，PBS-T洗3次，加入1100稀释的ORF2.3免疫豚鼠抗血清，对照管加入正常豚鼠血清，37℃，1h，加新鲜制备的HEV阳性粪便超速离心样品200μl，37℃，2h，PBS洗涤5次，加入20μl反转录体系进行反转录反应，之后进行套叠式PCR，第一循环反应体积100μl，引物为F2与R2，第二循环反应体积50μl，引物为F3与R3，PCR条件为95℃ 30s; 58℃ 30s; 72℃ 30s，共30循环。取5μl 1.5%琼脂糖电泳分析。

结果

1.抗原片段的表达与Western blot:菌体经诱导可见在相对分子质量(M_r)为14×10³左右有一表达条带，与预期M_r相符，其以包涵体形式存在，经洗涤及两步变性柱层析纯化后包涵体纯度达98%以上，Western blot结果表明，ORF2.3与阳性血清在预期位置有特异结合条带，而与正常阴性血清无反应(图2)。

图2表达产物的SDS-PAGE与Western blot分析

Fig 2. Anlaysis of SDS-PAGE and Western blot of expression products

A： 12% SDS-PAGE

M. Low moleculer protein markers; 1. pBVORF2.3/DH5α cultured at 30℃; 2. pBVORF2.3/DH5α 2h after induced at 42℃; 3. pBVORF2.3/DH5α 4h after induced at 42℃; 4. Inclusion bodies purified with gel filtration and anion exchange chromatography;

B： Western blot

1. Experimental groups; 2. Negative controls

2.对感染恒河猴血清中HEV IgG抗体的检测：实验对照猴M1无HEV IgG抗体阳转，实验猴M2与M3抗体分别在感染后第18天与24天阳转，并可维持6个月左右(图3)。

图3实验恒河猴感染HEV后IgG抗体的动态变化

Fig 3. Dynamics of anti-HEV IgG conversion of experimental macaques infected with HEV

3.动物免疫：ORF2.3免疫豚鼠，能够刺激机体产生抗体，抗血清效价为18000。

4.抗原捕获RT-nPCR：实验组扩增到243bp的HEV特异性条带，大小与常规检测阳性结果一致，而对照组无特异扩增条带(图4)。

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