【 摘要 】目的获得具有抑制血管内皮细胞生长活性的重组人内皮抑素（recombinant human endostatin）。 方法从肝细胞中分离总RNA，经反转录多聚酶链反应（RT-PCR）得到endostatin全基因。用原核细胞表达载体构建了pBV220/endostatin重组质粒，经DNA测序确认后，将其转化大肠杆菌DH5α进行表达、初步纯化及活性测定。 结果经SDS-PAGE分析，表达产物相对分子质量(M_r)约20×10³，薄层扫描显示表达产物可达细菌总蛋白的30%。 结论经生物学活性测定，表达蛋白能够抑制碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对牛毛细血管内皮细胞(BCEC)的增殖作用。

Cloning and expression of recombinant human endostatin and its antiangiogenic activity

LI Wen, ZHU Meicai, WANG Yinjing, et al.

（General Hospital Air Force PLA, Beijing 100036,P.R.China）

【 Abstract 】ObjectiveTo construct an engineering bacteria which can express human endostatin protein with biological activity. MethodsHuman endostatin gene fragment was acquired from human fetal liver total RNA by means of RT-PCR. The gene was inserted into prokaryotic expressing vector pBV220 and transformed into E.coli DH5α. Endostatin was expressed in the E.coli and the inclusion body was isolated, solubilized and then refolded. ResultsSDS-PAGE analysis showed that expressed product was about M_r 20×10³ and took up about 30% in bacterial total protein. ConclusionThe recombinant human endostatin protein can inhibit proliferation of bovine capillary endothelial cells dependent on bFGF.

【 Subject words 】Endostatin; Polymerase chain reaction; Gene expression; Antiangiogenesis

1997年O′Reilly等^〔1〕从一小鼠血管内皮瘤中发现了一种新的血管生成抑制剂，命名为endostatin(内皮抑素)。它能特异性地抑制内皮细胞增生，有效地抑制血管生成和肿瘤生长。并证实endostatin是一相对分子质量(M_r)为20×10³的胶原蛋白十八的C末端片段。将基因工程表达的小鼠endostatin用于荷瘤小鼠，在抑制原发肿瘤生长及肿瘤转移方面均取得了非常明显的效果。endostatin的发现对肿瘤发生及转移机制的深入研究，以及在癌症的临床治疗方面都具有十分重要的意义和前景。目前为止，国内尚未见有关人endostatin研究的正式报道。我们构建了人endostatin重组质粒，并在大肠杆菌中进行表达。经初步纯化，复性的endostatin能明显抑制血管内皮细胞的生长。现报道如下。

材料和方法

菌株、质粒及其它：大肠杆菌DH5α为本室保存菌株。表达质粒为预防医学科学院病毒所构建的pBV220。PCR引物由军事医学科学院二所合成。肝细胞来源于本院妇产科引产胎儿肝脏。

主要试剂：Trizol试剂、RT-PCR试剂盒及T4 DNA连接酶为Gibco产品；DNA限制性内切酶为Biolabs产品；小提质粒试剂盒为Promega 产品；DMEM培养基为Gibco产品；bFGF为白鹭园生物工程公司产品。

RT-PCR反应：肝细胞总RNA的提取及反转录按Gibco试剂盒说明书操作。反转录引物为试剂盒提供的Oligo dT。反转录合成第一链后，加入PCR扩增引物。引物1: 5′ GGA ATT CAT GCA CAG CCA CCG CGA CTT C 3′; 引物2: 5′ CGG GAT CCT ACT TGG AGG CAG TCA TG 3′。PCR反应条件：94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min。35次循环后，在72℃继续延伸7min。

构建重组质粒：扩增的PCR产物进行酚抽提。将其与pBV220载体分别用EcoRⅠ、BamHⅠ进行双酶切，走低熔点胶电泳，回收片段，酚抽提。DNA的酶切、连接及转化均参照Sambrook^〔2〕的方法进行。转化的受体菌为E.coli DH5α。对转化长出的菌落进行小提质粒，用限制性内切酶进行初步鉴定。

核酸序列分析：重组质粒样品用ABI公司377 DNA自动测序仪进行DNA自动测序。

重组质粒在大肠杆菌中的表达：挑选单个菌落接种于含Amp的2×YT培养基中30℃振摇过夜。次日按1%比例将菌液扩大培养至吸光度A600达0.5～0.6时，转入42℃诱导培养4h后收获菌液。在不同诱导时间取少量菌液加含有DTT的SDS样品缓冲液95℃5min，进行SDS-PAGE鉴定。

初步纯化、复性及活性测定：4000r/min离心10min收集经诱导后的细菌，以50mmol/L Tris-HCl-5mmol/L EDTA(pH8.2)洗菌体，再离心收集菌体。重悬浮于洗涤缓冲液中，用超声波破碎菌体，12000r/min 20min收集包涵体沉淀。将包涵体沉淀以洗涤缓冲液洗1次，离心回收。取少量进行SDS-PAGE 鉴定。余菌溶解于50mmol/L Tris-HCl-5mmol/L EDTA(pH8.2)-10mmol/L DTT-8mol/L尿素溶液，并对洗脱缓冲液透析复性过夜。离心去除沉淀，将上清浓缩并参照BioRad法测定蛋白含量。测活细胞为牛毛细血管内皮细胞(BCEC)，由本室参照Judah^〔3〕方法建立。测活方法基本参照Stephen^〔4〕所述。将培养于DMEM（含10%小牛血清＋bFGF 12μg/ml）的BCEC接种于微孔培养板（5.0×10³细胞/孔），37℃培养。次日将粗提表达产物以60、30、15、7.5、3.75μg/ml浓度加入细胞孔中，以不加样品的细胞孔为对照。同时观察空白质粒pBV220转染E.coli的细胞裂解液对内皮细胞生长的影响。37℃培养72h后在倒置显微镜下观察细胞存活情况。吸去培养上清，用0.2ml/孔PBS洗1次，吸去PBS，每孔加入0.1ml含0.25%胰酶的缓冲液，37℃消化5min，将消化下的细胞用滴管混匀，计数。

结果

1.RT-PCR扩增产物特性：经2%琼脂糖凝胶电泳和EB染色，在紫外灯下显示出一条相对分子质量近560bp的条带，与拟扩增片段大小基本相符。

2.阳性克隆的鉴定：应用DNA重组技术将endostatin基因片段插入pBV220表达载体的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点之间。见重组质粒构建示意图 (图1)。用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定其重组质粒DNA，可得到一约560bp的条带和一与pBV220空载体一致的条带 。

3.克隆片段的核酸序列分析：对克隆片段的全长序列分析结果显示，所测片段的核酸序列与文献报道^〔5〕的完全一致。表明所克隆的片段确系人endostatin基因。

图1重组质粒构建示意图

Fig 1. Schematic diagram of recombinant plasmid construction

4.重组质粒在大肠杆菌中的表达：将诱导表达的全菌进行SDS-PAGE，经考马斯亮蓝R-250染色，结果见图2。在M_r约为20×10³处可见一染色蛋白带，即表达的成熟人endostatin。经薄层扫描分析，表达产率可达30% 。包涵体沉淀中endostatin的含量大于70%。

图2重组质粒工程菌表达产物的SDS-PAGE

Fig 2. SDS-PAGE of expressed product of engineered bacteria

10% polyacrylamide gel, stained with Coomassie blue.

Lane 1: engineering bacteria before induction; Lane 2: engineering bacteria induced for 2 hours(h); Lane 3: engineering bacteria induced for 3 h; Lane 4: engineering bacteria induced for 4 h; Lane 5: protein molecular weight standard; Lane 6: inclusion body precipitate

5.活性结果：以只加bFGF的细胞为对照，加入样品孔的BCEC于24h后开始不同程度死亡，形态及折光性出现异常，活细胞数量明显减少，并随着加入endostatin量的增加其变化更加显著。72h后，15μg/ml组即与对照组呈现明显差异。加入endostatin(30μg/ml)72h后的BCEC与未加样品的BCEC比较见图3A；不同浓度endostatin对BCEC的抑制作用见图4。而空白质粒pBV220转染E.coli的细胞裂解液对内皮细胞生长无抑制作用。

图3人endostatin对BCEC生长的抑制作用

Fig 3. The inhibition of human endostatin on the bFGF dependent growth of BCEC (100×)

The BCEC were cultured in DMEM medium containing bFGF

A. bFGF only; B. bFGF plus human endostatin (30μg/ml)

讨论

近年来，血管生成抑制剂在肿瘤治疗方面的研究日趋活跃。endostatin作为其代表之一，具有如下特点：它是存在于体内的天然抗血管生成蛋白，能够特异地抑制血管生成，从而造成肿瘤饥饿状态。在实验动物中，可使肿瘤缩小或消失；与传统化疗药物相比，在反复使用过程中，它不产生严重的毒副反应，并且不