【 摘要 】目的研究人骨髓瘤细胞KM-3中的IL-6信号转导途径与生物学效应之间的关系。 方法分别采用MTT、凝胶阻滞电泳（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）、免疫沉淀方法检测IL-6对KM-3细胞生长状态的影响、参与IL-6信号传递功能的转录因子以及蛋白激酶在KM-3细胞中的诱导激活状态。 结果IL-6可明显促进KM-3细胞增殖，并可引发Ras/NF-IL-6信号转导途径活化，但Jak/STAT信号途径没有激活。 结论Ras/NF-IL-6信号转导途径介导了IL-6对KM-3细胞的生长促进作用。

The biological function of IL-6 on a human multiple myeloma cell-KM-3 is mediated by Ras/NF-IL-6 signal transduction pathway

SONG Lun, SHEN Beifen.

（Institute of Basic Medical Science, Academy of Military Medical Science, Beijing 100850, P. R. China）

【 Abstract 】ObjectiveTo investigate the relationship between the IL-6 signal transduction pathways and its biological function on a human multiple myeloma cell line-KM-3. MethodsMTT, EMSA and immunoprecipitation were used respectively to detect the effect of IL-6 on the growth of KM-3 cell, the activation of transcription factors and protein kinase in the two IL-6 signal transduction pathways by IL-6 in the same cells. ResultsIL-6 can promote the proliferation of KM-3 cells and activate one of the IL-6 signal transduction pathway-Ras/NF-IL-6; but the Jak/STAT signal transduction pathway was not activated at the same conditions. ConclusionThe biological function of IL-6 on the KM-3 cells is mediated by Ras/NF-IL-6 signal transduction pathway.

【 Subject words 】IL-6; Multiple myeloma; Signal transduction; Biological function

白细胞介素6（IL-6）是一种多功能的细胞因子，在不同类型的靶细胞上可以体现出多种不同的生物学效应。目前的研究结果认为：IL-6在各种靶细胞中的信号转导途径主要有两条，Jak/STAT途径和Ras/NF-IL-6途径，而且它们可能分别介导IL-6的各种不同的生物学功能^〔1〕。

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种晚期B细胞肿瘤，而IL-6是维持MM细胞生存和促进其生长的一种最重要的细胞因子^〔2〕。我们以一株具有IL-6增殖反应性的MM细胞系——KM-3作为靶细胞，研究了IL-6促进MM细胞增殖过程中所涉及的信号转导机制。

材料与方法

主要试剂：重组人IL-6由军事医学科学院生物工程研究所提供；α-³²P-dATP购自北京福瑞公司；用于EMSA实验的寡核苷酸引物由本室合成（OPC柱纯化）；PD98059购自Biolabs公司。抗ERK多克隆抗体和抗Jak1多克隆抗体购自SantaCruz公司；抗磷酸酪氨酸抗体PY20购自Transduction Laboratory。

细胞系：人骨髓瘤细胞系KM-3由第二军医大学侯健教授提供，用含有10%小牛血清的RPMI 1640培养基传代培养。

MTT方法检测IL-6对KM-3细胞生长状态的影响：将传代培养的KM-3细胞于无血清1640培养基中饥饿12～16h，然后以2.5×10⁴个/ml的浓度接种入96孔板（每孔100μl），并以每孔200μl为终体积补加梯度稀释的IL-6和含10%牛血清的1640培养基，72h后加入MTT（5mg/ml，每孔15μl），代谢4～6h后加入酸性SDS溶液溶解过夜并于570nm处测定光吸收值。

细胞核蛋白提取和凝胶阻滞电泳：参见文献〔3〕。DNA探针为分别能够与STAT3结合的APRE、与NF-IL-6结合的NF-IL-6/ATF。

免疫沉淀：取KM-3细胞5×10⁶ ～1×10⁷个为一个样品，细胞预处理及刺激同核蛋白提取^〔3〕。在刺激后的每一个细胞样品中加入0.25～ 0.5 ml的细胞裂解缓冲液（50mmol/L Tris-Cl，pH7.5，150mmol/L NaCl，1% NP40，0.5mmol/L EDTA，0.5mmol/L EGTA；临用前补加1mmol/L Na₃VO₄、10mmol/L NaF、2mmol/L PMSF和10μg/ml aprotinin，pepstin，leupep）冰浴作用30min后，12000×g离心20min，弃沉淀，上清即为细胞裂解蛋白。在以上每份蛋白产物中加入抗ERK（或抗Jak1）抗体4μg，4℃作用2h，再加入prA-agarose珠（Gibco）20μl，4℃作用4h或过夜。在进行电泳前将agarose珠用洗涤缓冲液（除NP40浓度降至0.1%以外，其余成分同以上裂解缓冲液）和PBS溶液各洗3遍，然后进行10% SDS-PAGE，按常规方法转印，并分别用抗ERK（或抗Jak1）和抗磷酸酪氨酸抗体PY20进行识别，用AP标记的二抗及其底物BCIP、NBT显色。

表达质粒转染KM-3细胞：采用Gibco公司Lipofactamine转染试剂并按其产品说明书方法进行。

结果

1.IL-6促进KM-3细胞增殖：图1显示MTT结果，在0.001～10ng/ml的范围内，随着IL-6刺激浓度的增加，KM-3细胞的增殖效应明显增强。提示KM-3细胞对IL-6具有一定的剂量-效应增殖反应性。

图1IL-6对KM-3细胞生长情况的影响

Fig 1．Effect of IL-6 on the growth of KM-3 cells

2.IL-6诱导KM-3细胞中转录因子NF-IL-6活化：为了研究IL-6对KM-3细胞的生长促进作用由哪条IL-6信号转导途径介导，我们首先采用EMSA方法检测了参与两条IL-6信号转导途径的转录因子STAT3和NF-IL-6在KM-3细胞中的诱导激活情况。我们采用能够引发明显促增殖效应的IL-6剂量刺激KM-3细胞10min后提取细胞核蛋白，并与探针APRE、NF-IL-6/ATF结合，图2A结果显示：IL-6刺激后没有出现STAT3活化信号；而NF-IL-6在IL-6刺激前即处于组成性激活状态，IL-6刺激后其活化信号明显增强。同一有效IL-6剂量（10ng/ml）在刺激不同时间点的EMSA结果（图2B）也显示出：IL-6的刺激可使NF-IL-6出现一过性激活信号（30min之内），60min后恢复至刺激前水平；而STAT3在各个时间点没有相应的活化。以上结果提示：NF-IL-6参与的Ras/NF-IL-6信号转导途径能够在KM-3细胞中诱导激活。

图2STAT3和NF-IL-6在KM-3细胞中的诱导激活情况

Fig 2．Activation of NF-IL-6 and STAT3 in KM-3 cells by IL-6

KM-3 cells were treated 10 min with different dose of IL-6 in A；while 10ng/ml IL-6 was used to stimulate the cells with different time in B

3.IL-6诱导KM-3细胞中蛋白激酶ERK活化：在两条IL-6信号转导途径的级联活化反应中，催化转录因子NF-IL-6和STAT3活化的蛋白激酶分别是ERK（MAPK）和Jak。我们采用免疫沉淀方法检测ERK和Jak激酶家族的Jak1在KM-3细胞中的诱导激活情况(图3)。在用抗Jak1（或ERK）抗体免疫沉淀相应的目标蛋白后，抗Jak1（或ERK）抗体可分别识别出IL-6刺激前后KM-3细胞中表达量基本相同的Jak1（或ERK）；而抗磷酸酪氨酸抗体PY20只识别出IL-6刺激前组成性激活的ERK以及IL-6刺激后活化信号显著增强的ERK，但Jak1没有出现活化信号。以上两部分结果说明：在KM-3细胞中，IL-6的刺激只能引发Ras/NF-IL-6信号途径激活，而没有Jak/STAT途径的诱导活化。

图3蛋白激酶Jak1和ERK在KM-3细胞中的诱导活化情况

Fig 3．Activation of protein kinases Jak1 and ERK in KM-3 cells by IL-6

IP:immunoprecipitation；IB:immunoblot；α-ERK:antibodities to ERK；α-Jak1： antibodies to Jak1；α-p-Tyr:antibodies to phosphotyrosine

4.PD98059对KM-3细胞IL-6增殖反应性和信号转导功能的影响：PD98059是参与Ras途径的蛋白激酶MEK（MAPKK）的特异性抑制剂，对Tyr蛋白激酶的活性没有影响^〔4〕。它的作用可以使KM-3细胞中NF-IL-6的组成性活化信号（图4A）和IL-6诱导激活信号（图4B）与对照组（只加PD98059的溶剂DMSO）相比明显减弱，这说明PD98059能够抑制KM-3细胞中Ras/NF-IL-6信号途径的活化；另外，图4C的MTT结果显示：PD98059能够抑制KM-3细胞的增殖及IL-6对它的生长促进作用，当PD浓度达到10μmol/L时可以完全逆转1 ng/ml IL-6对KM-3细胞的生长促进作用。这说明Ras/NF-IL-6信号转导途径介导了KM-3细胞的IL-6增殖反应性。

图4PD98059对KM-3细胞的NF-IL-6激活（A，B）和IL-6增殖反应性（C）的影响

Fig 4．Effect of PD98059 on the activation of NF-IL-6（A，B）and proliferation（C）of KM-3 cells in the presence of IL-6

5.NF-IL-6反义表达质粒对KM-3细胞IL-6增殖反应