1992年Mason等提出以转基因植物作为疫苗生产载体的概念，认为植物作为载体生产疫苗及其它医用蛋白，具有成本低廉，易于运输及适于口服等优点，并就此进行了一系列有突破性的研究。本文旨在对胡萝卜表达HBsAg做尝试性研究。含前S2的HBsAg基因来自噬菌体克隆M13/HB，经SalⅠ酶切后填平再以KpnⅠ酶切回收0.9kb片段，平端插入至分别经KpnⅠ与SmaⅠ酶切的植物表达载体pBPC55。该连接产物转化DH10b菌，提取质粒经酶切鉴定表明HBsAg基因正确插入到E35S启动子下游，新质粒长4.3kb，命名为pBPC91；切割无菌胡萝卜幼苗，诱导愈伤形成制备胡萝卜悬浮细胞，将此细胞转至MC1固体培养基培养5d后转化。将PEG纯化质粒pBPC91与植物筛选质粒pBPC93(提供GUS基因筛选及除草剂抗性)按等摩尔浓度混匀，使成为1μg/μl的质粒溶液，与金粉颗粒及CaC1
2、亚精胺充分混匀以PDS/He1000轰击转化上述培养细胞。转化后经含除草剂Bidaphos的培养基筛选，获得除草剂抗性胡萝卜细胞团(愈伤)。收集此愈伤在X-Gluc染液中处理，有蓝色沉淀形成，表明GUS蛋白表达；碱法提取细胞内总DNA用于PCR鉴定，设计双引物分别位于preS2起始位点及S基因终止部位，PCR扩增全长为0.9kb，分别采用pBPC91及未转化胡萝卜愈伤总DNA提取物作对照。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示1/3愈伤组织内有HBsAg基因转化。对PCR鉴定阳性的愈伤扩大培养，冷冻研磨成粉末加入缓冲液(0.1mol/L PBS pH7.0; 0.1mol/L醋酸钠；0.1% Triton X-100及2mmol/L蛋白酶切抑制剂PMSF)置4℃冰箱过夜。将过夜萃取物4℃离心，上清液经透析处理后再次离心，取离心后上清液100μl，双抗体夹心ELISA检测HBsAg及preS2-Ag，以未转化胡萝卜愈伤蛋白萃取物做对照，酶标仪检测记录吸光值，根据cut-off值判定结果，表明转化后的胡萝卜细胞萃取物中HBsAg及preS2-Ag均为阳性。
研究初步表明以转基因植物生产疫苗具有可行性，所建立的转化系统简洁、高效，可用做植物表达其它医用蛋白的研究。
基金项目：北京市自然科学基金资助项目(59620004)
(收稿日期：2000-03-13)
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