设为首页
加入收藏
求医中医药网
www.qe.cn
站内搜索
酵母双杂合体系(yeast two-hybrid system)的基本原理是利用酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)的一些转录因子(如：GAL4)在生理状态下，由两个可分离、相对独立的功能结构域组成：DNA结合结构域(DNA-BD，DNA-binding domain)和转录激活结构域(DNA-AD，transcription activation domain)。DNA-BD可与DNA的启动序列——上游激活序列(UAS，upstream activation sequence)结合，DNA-AD则能促使转录复合物形成，使转录过程开始。DNA-BD与DNA-AD这两个独立的蛋白能够通过非共价键形成一个有功能的转录因子。在正常分离状态下，或与两个不能相互作用的蛋白融合表达时，DNA-BD与DNA-AD都没有转录激活功能。但是，当他们分别与两个能相互作用的蛋白(x,y)融合表达时(BD-x,AD-y)，就能形成一个完整的有活性的转录因子，激活由DNA-BD结合的UAS下游报告基因的转录表达。因此，可通过报告基因是否被转录来研究两蛋白间的相互作用。酵母双杂合系统属于体内实验，完全模拟体内环境下的两个蛋白间相互作用。体内反应能保持蛋白结构的构象完整性，因此能提高其反应的敏感性和精确性，为检测瞬间的和相对弱的蛋白间作用提供了一个敏感的方法。
本实验参照中国HBV-adr亚型的DNA序列设计引物，以HBV DNA 阳性血清为模板扩增preS基因，PCR产物片段以T4连接酶连于含GAL4结合结构域的pAS2-1载体上，经双酶切分析证明连接片段大小正确，用乙酸锂转化法转入酵母细胞AH109中，PCR由转化后的酵母细胞中扩增出HBV preS基因序列，证实AH109中已转入含preS序列的载体。培养酵母细胞的裂解产物，经SDS-PAGE电泳，Western杂交，在阳性菌株中可见与GAL4 BD单克隆抗体反应的相对分子质量约35×103的特异性杂交带，而空酵母菌阴性对照没有杂交带。证明preS在AH109体内没有自身激活作用。
DNA结合结构域与外源基因融合形成的杂交体(BD-x)通常称为诱饵质粒(bait plasmid),所表达的蛋白为饵蛋白(bait protein)。饵蛋白通常是我们所要研究的已知蛋白。将另一蛋白“y”与DNA激活序列相融合。如果将“y”改成基因文库，就可以通过“饵”蛋白直接从基因库中筛选到能与饵蛋白相作用蛋白的DNA序列。将HBV preS蛋白作为饵蛋白构建质粒，可以从肝细胞的cDNA文库中直接筛选与preS相作用的蛋白，制备出受体模拟分子，阻断病毒的入胞，从而为预防和治疗乙型肝炎打下基础。
本实验以HBV preS所建“饵”载体pAS2-preS,能在酵母细胞中稳定表达，没有激活报告基因的作用，能够用于酵母双杂合体系的筛库工作。(收稿日期：1999-11-15)
