【 摘要 】目的研究DNA旋转酶、拓扑异构酶Ⅳ在伤寒沙门菌耐喹诺酮类药物的作用。 方法对临床分离喹诺酮类敏感伤寒沙门菌275及其自发耐药变异菌RG₁的gyrA、parC基因喹诺酮类耐性决定区进行PCR DNA直接测序分析。 结果表明伤寒沙门菌275 gyrA、parC与大肠埃希菌相应DNA序列分别有92.51％与97.01％同源性，推定氨基酸序列仅有3与6个的差异。伤寒沙门菌gyrA及parC也有较好同源性，相应区段氨基酸有60.92 ％相同。伤寒沙门菌RG₁与275相比，gyrA第247位T→G变异，致Ser 83 Ala氨基酸替换，两者parC完全相同。喹诺酮类药物对RG₁ MIC较对伤寒沙门菌275上升32倍或以上。 结论DNA旋转酶、拓扑异构酶Ⅳ为喹诺酮类药物作用靶位，但以DNA旋转酶为主，该酶变异为伤寒沙门菌耐药的主要原因。

A study on the correlation of quinolone resistance with mutationsin DNA gyrase gyrA and topoisomerase Ⅳ

parC genes in Salmonella typhi

XIAO Yonghong, WANG Qi′nan. The First Affiliated Hospital, Chongqing

University of Medical Sciences, Chongqing 400016, P.R.China

【 Abstract 】ObjectiveTo study the correlation of quinolone resistance with mutations in DNA gyrase gyrA and topoisomerase Ⅳ parC genes in Salmonella typhi. MethodsThe quinolone-resistance determining regions of gyrA and parC in Salmonella typhi 275(a clinically isolated strain, S275) and its spontaneous resistant mutant RG₁ were sequenced. ResultsThe results showed that the sequenced regions of gyrA and parC in S275 had 92.51% and 97.01% homology with those of Escherichia coli respectively, which led to 3 and 6 substitutions in deduced amino acids in gyrA and parC. The gyrA and parC of S275 also had high homology in amino acid sequence as much as 60.92%. In comparison with S275, gyrA of RG₁ had a mutation of T247 G which contributed to the substitution of Ser 83 to Ala in gyrA. No difference was found in parC of S275 and RG₁. The MICs of quinolones on RG₁ were higher than those on S275 by 32 folds or more. ConclusionThese results indicated that both DNA gyrase and topoisomerase Ⅳ of S.typhi are targets of quinolones while DNA gyrase is more important as the target molecules. Its mutation seems to be the major mechanism to explain quinolone-resistance in S.typhi.

【 Subject words 】Salmonella typhi; Quinolones; DNA gyrase; Topoisomerase Ⅳ; Sequence analysis

伤寒为我国常见传染病，氟喹诺酮类作为主要治疗药物受到广泛认可。喹诺酮类主要通过抑制细菌DNA复制、转录起到杀菌作用，其作用位点为DNA旋转酶。近年发现细菌DNA拓扑异构酶Ⅳ活性也受喹诺酮类抑制，与DNA旋转酶共同构成喹诺酮类作用靶位，对不同细菌两者所起作用有所差异，在革兰氏阳性菌拓扑异构酶Ⅳ为第一靶位^〔1,2〕。为研究在伤寒沙门菌中两者所起作用，我们用临床分离喹诺酮敏感伤寒沙门菌275(简称S275)及其体外筛选的耐药菌RG₁(简称RG₁)对DNA旋转酶gyrA及拓扑异构酶ⅣparC基因之耐喹诺酮类决定区(quinolone-resistant determining region, QRDR)进行PCR扩增及核酸序列分析，结果如下。

材料与方法

菌株：伤寒沙门菌S275为我院1996年临床病人血培养分离所得对喹诺酮类敏感的菌株，用平板法筛选其耐药变异株RG₁。挑取单个伤寒沙门菌S275菌落接种于10ml Mueller-Hinton肉汤(MHB，1000ml含牛肉浸膏5g，水解酪蛋白17.5g，可溶性淀粉1.5g)，过夜培养后，以少许菌液均匀涂布于含4μg/ml(2×MIC)萘啶酸的Mueller-Hinton琼脂(MHA)，37℃孵育48h后，得耐药变异株RG₁，与S275共同用于下列研究。

抗菌药物及主要试剂：氧氟沙星(OFLX)由日本第一制药株式会社提供，环丙沙星(CPFX)为太原制药厂提供，萘啶酸购自Sigma公司。多聚酶链反应扩增DNA旋转酶A亚单位基因(gyrA)上游引物为：5′-TGTCCGAGATGGCCTGAAGC-3′，位于大肠埃希菌gyrA 108～127位碱基；下游引物为5′-TGCCGTCATAGTTATCAACG-3′，与大肠埃希菌gyrA 435～454位碱基互补。拓扑异构酶Ⅳ亚单位C基因(parC)上游引物为5′-GTATGCGATG TCTGAACTGG-3′，位于大肠埃希菌parC基因第163～182位碱基；下游引物5′-GTGGTGCCGTTAAGCAAA-3′与大肠埃希菌parC基因第517～534位碱基互补。上述引物均委托中国科学院微生物研究所基因工程中心合成。合成仪为Beckman Oligo 1000型。dNTP、Taq酶、限制性内切酶HinfⅠ、Wizard PCR产物纯化试剂盒、DNA银染试剂盒均购自Promega公司；DNA测序试剂盒为Perkin-Elmer之末端标记试剂盒。

药敏试验：以试管双倍稀释法测定抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)。过夜生长的细菌，以生理盐水稀释为0.5麦氏单位，加入到倍比稀释抗生素的系列MHB中，使最终接种量为(10⁴～10⁵CFU)/ml，37℃孵育18h后观察结果，以确定抑制细菌生长的最低药物浓度(MIC)。

多聚酶链反应扩增gyrA与parC：参考文献方法^〔3〕。1ml过夜培养的伤寒沙门菌10000×g，5min收集沉淀，加入600μl TE缓冲液(pH8.0)混悬，加入10％SDS 30μl，37℃孵育1h后，用等量酚、酚氯仿、氯仿抽提后作模板DNA。50μl反应混合物含10mmol/L Tris-HCl(pH9.0)、50mmol/L KCl、0.1％ Triton X-100、1.5mmol/L MgCl₂、0.2mmol/L dNTP、1U Taq酶、上下游引物各50pmol、DNA模板2μl。初始循环94℃，1.5min；60℃，2min；72℃，3min。后续94℃，1min；60℃，1min；72℃，3min；30循环。最后72℃延伸15min。产物以2％琼脂糖电泳，0.5μg/ml溴化乙锭染色，紫外光下观察结果。核酸相对分子质量标准为pBR322/HinfⅠ片段。

PCR产物测序：利用PCR产物纯化试剂盒，按产品说明纯化gyrA、parC PCR产物，纯化产物以前述引物为引物，用末端标记测序试剂盒，在Perkin-Elmer ABI 310型自动测序仪测序。

结果

1.药敏试验：NA、OFLX、CPFX对S275的MIC值分别为2、0.06、＜0.03mg/L，对RG₁则为512、2、1mg/L，较对伤寒沙门菌275明显上升32倍以上。

2.gyrA测序结果及推定氨基酸序列(图1、2)：S275 gyrA QRDR与大肠埃希菌KL-16高度同源，两者仅23个碱基差异，占所测序列碱基的7.49％，且大部分为保守替换，推定氨基酸序列仅有3个差异，第45、49与56位氨基酸分别为Thr→His，Arg→Leu及Val→Gly变异^〔4〕。RG₁碱基仅于274位T→G变异，致相应第83位氨基酸由Ser→Ala变异，该位变异导致疏水性发生改变而与药物亲和力降低，细菌敏感性降低。

图1伤寒沙门菌与大肠埃希菌gyrA耐喹诺酮类决定区核苷酸序列（*示与S275相同）

Fig 1. The uncleotide sequence of gyrA QRDR in S.typhi and E.coli

*：indicated the same as that of S275

图2伤寒沙门菌与大肠埃希菌gyrA推定氨基酸序列（*示与S275相同）

Fig 2. The deduced amino acid sequence of gyrA QRDR in S.typhi and E.coli

* indicated the same as that of S275

3.parC测序结果及推定氨基酸序列(图3、4)：S275 parC基因所测部分序列与大肠埃希菌高度同源，两者仅有10个碱基差异，占所测序列的2.99％，致推定氨基酸序列6处差异^〔5〕。RG₁与S275完全相同。

图3伤寒沙门菌与大肠埃希菌parC耐喹诺酮类决定区核苷酸序列（"示与伤寒沙门菌相同）

Fig 3. The nucleotide sequence of parC QRDR in S.typhi and E.coli

′′ indicated the same as that of S.typhi

图4伤寒沙门菌与大肠埃希菌parC耐喹诺酮类决定区推定氨基酸序列（*示与伤寒沙门菌相同）

Fig 4. The deduced amino acid sequence of parC QRDR in S.typhi and E.coli

* indicated the same as that of S.typhi

伤寒沙门菌parC序列与gyrA比较，两者所测部分同源性高，推定氨基酸有60.92%(53/87)相同，尤以位于parC<