【 摘要 】目的对在用PCR/SSO方法作我国彝族群体样本HLA D区寡核苷酸分型中发现的1例DRB1的杂合子进行等位基因序列分析。方法用DRB基因类引物扩增该特殊的DRB1杂合子细胞基因组的DRB基因的第二外显子。扩增产物经纯化转染大肠杆菌JM101，克隆后再经酚/氯仿抽提后得到单链M13 DNA。利用ABI 377测序仪自动测序。结果彝族这一特殊的DRB1杂合子细胞的DRB1基因阳性克隆，经序列分析证实了该DRB1杂合子中一个等位基因确为DRB1*1202，与PCR/SSO分型一致；另一个新等位基因DRB1*15Y2(暂定)等位基因在第二外显子的47位由编码苯丙氨酸的TTC(DRB1*1502)变为编码酪氨酸的TAC。结论在云南彝族样本中发现的DRB1*15Y2，其47位由TAC(酪氨酸)置换了相应于DRB1*1502的TTC(苯丙氨酸)。在我国这样一个多民族国家中，就HLA系统而言，可能还有更多新等位基因有待鉴定。这样有助于完善群体遗传资料。

Nucleotide sequence of another novel DR15(2) allele in Yi Nationality ChineseJIANG Weihong,ZOU Yanqiong,LIN Biaoyang,et al.Department of Biology, Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025

【 Abstract 】ObjectiveOne special DRB1 heterozygote which was found in oligotyping of HLA D region in Chinese Yi population by using PCR/SSO method, was to be sequenced for the gene of the allele.MethodsAmplification of exon 2 of DRB gene in this heterozygote was carried out with genomic DNA templet and generic primers and the amplicon was cloned in M13 for further sequencing.ResultsOne allele was identified as DRB1*1202, another allele whose PCR/SSO hybridization pattern was similar to but different from DRB1*1502 was considered as DRB1*15 variant. Analysis of nucleotide sequence revealed that this allelic variant differed from DRB1*1502 at codon 47 (TAC instead of TTC), resulting in the substitution of a tyrosine for phenylalanine in the DRβ chain.ConclusionThe DRB1 heterozygote allele gene could be nominated as DRB1*15Y2 temporarily.

【 Subject words 】HLA antigenPolymerace chain reactionChinese YiBase sequenc

HLAⅡ类分子受控于HLA D区基因，主要包括DR、DQ和DP3个亚区。DR亚区的高度多态性归结于DRB基因，至今已鉴定有DRB1、DRB3、DRB4和DRB5基因座及几个假基因。因此，HLA分型已由血清学、细胞学的抗原特异性深入到DNA水平上的等位基因判别。国际上对这些基因座的等位基因进行了详细的群体研究，最终根据序列测定结果由WHO HLA 系统命名委员会正式命名。血清学分型的DR2有DR15和DR16两个亚型，DNA分型及序列分析已鉴定DRB1*1501-DRB1*1506和DRB1*1601-DRB1*1605、DRB1*1607、DRB1*1608等13个等位基因和11个DRB5等位基因^〔1-3〕。我国是一个多民族国家，南北地区的汉族和少数民族间的HLA等位基因频率均有很大差异^〔5〕。在对云南彝族样本进行HLA-DR亚区寡核苷酸分型中，费虹明等^〔6〕发现了一个新的DR15(2)等位基因，经鉴定后与当时WHO命名委员会正式命名为DRB1*1504一致^〔4〕，在我国为首次发现。本文报道在彝族样本中另有一例特殊的DRB1杂合子，其中一个等位基因是DRB1*1202，而另一等位基因的反应格局与已有的DR15(2)反应格局不同，可能是另一个新的等位基因。我们用DRB基因的类(generic)引物扩增该例杂合子细胞DR基因的第二外显子，对扩增产物进行克隆和序列测定，确认是另一新的DR15(2)等位基因，暂称之为DRB*15Y2。

材料与方法

1.PCR扩增：用国际组织相容性会议提供的DRB基因类引物(DRBAMP-A：CCCCACAGCACGTTTCTTG；DRBAMP-B：CCGCTGCACTGTGAAGCTCT)扩增特殊的DRB1杂合子细胞基因组的DRB基因的第二外显子。

2.扩增产物的克隆：扩增产物经纯化后通过T4连接酶连接于已用SamⅠ切成平整末端的M13mp18,转染大肠杆菌JM101，用β-半乳糖苷酶系统筛选含插入片段的阳性白色菌落。

3.序列分析：将阳性菌落在培养液中37℃培养过夜。12000×g离心后取上清液，加入PEG-8000，冰浴后再次12000×g离心10分钟，沉淀溶于TE缓冲液，经酚/氯仿抽提后得到单链M13 DNA。利用ABI 377测序仪自动测序。

结果

彝族这一特殊的DRB1杂合子细胞的基因组DNA经DRB基因的类引物扩增后并克隆。经筛选，分别获得了DRB1、DRB3和DRB5基因的阳性克隆。序列分析证实了该DRB1杂合子中一个等位基因确为DRB1*1202，与PCR/SSO分型^〔7〕一致；另一个新等位基因DRB1*15Y2等位基因在第二外显子的47位由编码苯丙氨酸的TTC(DRB1*1502)变为编码酪氨酸的TAC(图1)。该例细胞中DRB5基因为DRB5*02等位基因，但DRB3基因序列亦与已知者有差异(另文报道)。

图1DRB1*15Y2和DRB1*1501-1506各等位基因第二外显子的核苷酸序列

Fig 1. The exon 2 nucleotide sequence of DRB1*15Y2 aligned with other DRB1*1501-1506 alleles

讨论

HLA系统在人类基因组中具有高度多态性，可以作为遗传标志来研究人类的起源和迁移，在临床上也被用于疾病关联的研究和移植配型。HLA Ⅱ类抗原的分型从经典的血清学方法逐步深入到DNA水平的分型，通过PCR/SSO方法可以有效地鉴别仅有一个核苷酸之差的等位基因，且有更多的机会在群体中发现新的等位基因。我们在云南彝族样本中发现的DRB1*15Y2，其47位由TAC(酪氨酸)置换了相应于DRB1*1502的TTC(苯丙氨酸)，且该例杂合子细胞中的DRB3基因也与已发表的序列有差异。HLA多样性研究必将进一步丰富我中华民族群体遗传资源数据库，为人类学研究以及HLA与疾病关联研究提供更为精确的遗传信息。

本课题受国家自然科学基金资助

参考文献

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(收稿：1997-11-14修回：1998-06-29)