【 摘要 】目的对我国伯氏考克斯体（Cb）分离株的23S rRNA基因插入片段(23S IVS)作核酸序列分析。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增7株Cb中国分离株和2株外国参考株的23S IVS,用双脱氧核苷酸法对扩增产物进行测序。结果重庆，四川，内蒙分离株以及Henzerling和Grita等6株的IVS序列均相同，YS-8，YS-9和YH-11等云南分离株的IVS与前6株的比较仅少一个7个碱基的重复序列。结论Cb 23S IVS为高度保守基因片段，与高度异质性的钩端螺旋体的同源性基因片段不同；云南株和其它6株的IVS差别与Cb分离株的地理分布的不同有关，云南分离株可能为一亚种。

Analysis of the intervening sequences in 23S rRNA genes of the Chinese Coxiella burnetii isolatesCHEN Rong, WEN Bohai, ZHANG Xue, et al. Department of Microbiology, The Third Military Medical University, Chongqing 400038

【 Abstract 】ObjectiveTo study the nucleic acids sequence of the intervening sequences(IVS) carried by 23S rRNA genes of Coxiella burnetii(Cb).MethodsThe IVSs from seven Chinese isolates and two foreign reference strains were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and the amplimers were directly sequenced by dideoxynucleotide methods.ResultsThe IVSs of the isolated from different locations and sources in this study, except three isolates from Yunnan province, were identical. The IVSs of three Yunnan isolates from human and sheep were identical and they were devoid of one 7-base repeat unit which existed in the other 6 isolates.ConclusionsOur results demonstrated that the IVS of Cb is a highly conservative element in the chromosome and it is different from its homologous elements existing in the chromosome of Spirochete which are highly divergent among strains. The difference of Cb IVSs is related to the geographic distribution of the organisms and the Yunnan strains probably belong to a subspecies of Cb.

【 Subject words 】Coxiella burnetiiIntervening sequence23S rRNA

伯氏考克斯体（Coxiella burnetii, Cb）俗称Q热立克次体，是人和动物Q热的病原体，为革兰氏染色阴性的严格胞内寄生菌。该病原体在生物学、血清学以及遗传学特性上与其它立克次体有明显的差异。根据16S rRNA基因分析，该病原体被划分在变形菌纲的γ亚群内，而其它的立克次体则在α亚群^〔2〕。虽然目前Q热立克次体属内仅有一个伯氏立克次体种，但不同Q热立克次体分离株在抗原性、毒力、遗传等方面显示不同程度的差异。细菌的rRNA基因是高度保守基因，然而在某些细菌，包括耶尔森氏菌、沙门氏菌、弯曲菌、钩端螺旋体、假单胞菌以及Cb的23S rRNA基因中含有长度不等的插入序列（Intervening sequence, IVS）,大多数23S IVS不具有开放读码框（open reading frame）^〔2-4〕。Afseth等^〔5〕报道，Cb 23S IVS长444bp，构成一个开放读码框，与钩端螺旋体的23S IVS结构相似，它们的核酸推导的氨基酸序列同源性为70%。钩端螺旋体属几个种的23S IVS的碱基序列已被测定，其在种间和种内均有差异，依据其序列作种系发生分析，提示它们为染色体上的可在种间和株间横向转移的成分^〔6〕。而Cb 23S IVS株间是否也有不同尚未见报道。本研究将采用PCR扩增从我国不同地区、不同临床类型以及不同宿主所分离到的Cb菌株的23S IVS，测定它们的碱基序列，比较23S IVS的株间差异与菌株所在不同地区和不同宿主之间的联系，为Q热立克次体的分类、遗传及致病性等研究提供理论依据。

材料和方法

1.Cb分离株：本次研究共使用9株Cb分离株，七医（重庆），雅安（四川），李株（内蒙），YH-11（云南），Henzerling(意大利)和Grita（前苏联保存的希腊-意大利株）均从Q热病人中分离；YS-8和YS-9从云南绵羊胎盘中分离；新桥株则从重庆某单位动物实验室饲养的狗身上的铃头血蜱中分离。菌株均接种鸡胚，在卵黄囊膜中生长繁殖。每个感染卵黄囊涂片后经Giemsa染色，镜下每个视野可见50～100菌体。

2.DNA提取： 用PBS制备感染卵黄囊匀浆，每个卵黄囊加1ml PBS，用玻璃研磨器研磨成匀浆。取200μl匀浆用组织DNA提取试剂盒（QIAamp Tissue Kit, QIAGEN Inc, Chatsworth, Calif.，US）提取总DNA，总DNA稀释在200μl DNA稀释液中。整个操作过程遵循厂家所限定的方法。

3.PCR扩增23S IVS： 依据文献〔5〕报道的Cb 23S rRNA基因序列设计扩增Cb 23S IVS的引物：Cb 23S IVS F(5'CTTTAAAGAAAGCCTAATAG 3')定位在第989～1109碱基，Cb 23S IVS R(5'TTACTTTATGTCAGCATTCG 3')在第1702～1683位。0.5ml反应管内加入10μl总DNA被用作模板DNA, 1μl脱氧核苷酸三磷酸混合液(10mmol/L) (GIBCO BRL, Gaithersburg, US), 5μl PCR缓冲液（10×）,8μl MgCl₂ (15mmol/L) 和1.25U的Taq多聚酶（Sangon Ltd, Canada）,2pmol引物，最后补充双蒸去离子水至50μl总容量，液面上加入20μl石蜡油。PCR反应条件为94℃ 3分钟后，再行30个循环，每个循环为94℃ 1分钟，55℃ 1分钟和72℃ 1分钟。取10μl反应产物在1%琼脂糖凝胶（含0.5μg/ml溴化乙锭）上电泳，在紫外灯下观察结果。

用16S rRNA基因的通用引物^〔7〕A-17(5'GTTTGATCATGGCTCAG 3'),3-17 (5'AAGGAGGTAATCCAGCC 3')对模板DNA进行扩增，作为系统对照。PCR反应体系同上。

4.DNA碱基序列测定： 依据已知的Cb 23S rRNA基因序列^〔5〕，在PCR引物与23S IVS之间设计一对测序引物：Cb IVS F-Seq(5'TCACTGGTCGAGTCGTC 3')位于已知序列的1111～1127碱基处，Cb IVS R-Seq(5'ATTCGCACTTCTGATACC 3')在1687～1670位上。DNA序列测定采用双脱氧核苷酸法。使用双链DNA循环测序系统（Double-Stranded DNA Cycle Sequening System, GIBCO BRL)，依据公司提供方法进行。

结果

1.PCR扩增IVS：9株Cb分离株均扩增到一约700bp的基因片段（图1），而大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎衣原体、普氏立克次体、莫氏立克次体、黑龙江立克次体6个对照菌均为阴性（图2）；6个对照菌均扩增到一约1.5kb的16S rRNA基因片段（图3）。

图19株Cb分离株的23S IVS PCR扩增结果

Fig 1. 23S IVS PCR product of 9 Cb isolates

Lane 1. YH-11；lane 2. YS-9;lane 3. YH-8;lane 4. 1kb DNA ladder(Promega,US);lane 5.Henzerling;lane6. Grita;lane 7.Li; lane 8. Ya-an;lane 9.Xin-qiao; lane 10.Qi-yi

图26个对照菌和Cb七医株23S IVS PCR扩增结果

Fig 2. 23S IVS PCR products of 1 Cb isolate and 6 other bacteria

Lane 1.1kb DNA ladder(GIBCO BRL,US);lane 2. Cb(Qi-yi);lane 3. no DNA template;lane 4. E.coli; lane 5.Pseudomonas aeruginosa;lane 6. Chlamydia pneumoniae; lane 7.Rickettsia mooseri; lane 8.R. prowazekii; lane 9.R.heilongjingi 054

图36个对照菌和Cb七医株的16S rRNA PCR扩增结果

Fig 3. 16S rRNA PCR products of 1 Cb isolate and 6 other bacteria

Lane 1.1kb DNA ladder(GIBCO BRL,US);lane 2.Cb(Qi-yi);lane 3.E.coli; lane 4.Pseudomonas aeruginosa; lane 5.Chlamydia pneumoniae; lane 6.Rickettsia mooseri; lane 7.R.heilongjingi 054; lane 8.R.prowazekii; lane 9.no DNA template

2.测定23S IVS序列：9株Cb 23S IVS序列均已测得。七医、雅安、李株、新桥、Henzerling和Grita 6株的序列均相同。但比Afseth报告的Cb 23S IVS在28位上多一个ATGACAG重复序列，在342位上少一个G，在3'末端（375位）多一个碱基A，在377和378位上的CG为GC碱基；YS-8，YS-9和YH-11等3株与前6株比较少一个ATGACAG重复序列，其它序列则相同（图4）。

图4考克斯体的三种23S rRNA基因IVS

Fig 4.Three types of IVSs of 23S rRNA genes of Coxiella burnetii US IVS from the Cb 23S rRNA gene sequence^〔5〕;Qi-yi (Xin-qiao,Ya-an,Li,Grita