【摘要】目的鉴定朊蛋白(PrP)基因转录启动子位置。方法利用聚合酶链反应(PCR)扩增人PrP基因外显子Ⅰ及其上游序列，序列鉴定后插入CAT报道质粒pBL-CAT6，分别转染HeLa、COS7和Sh-sy5y细胞系，检测CAT表达值；提取三种细胞蛋白，以条带移动实验检测细胞转录激活因子SP1含量。结果人PrP基因外显子Ⅰ及其上游序列为GC富含，带有多个SP1可能性结合位点，但无明显TATA盒；瞬时转染结果显示这段序列可诱导2～3倍的CAT表达增强；定量移动条带实验证明HeLa细胞中含有较高浓度的SP1，而COS7和Sh-sy5y细胞中SP1含量极低。结论人PrP基因外显子Ⅰ及其上游序列具有启动子样功能，为弱的非TATA盒启动子；不同组织来源的细胞中SP1含量不同，在神经细胞系Sh-sy5y中人PrP基因外显子Ⅰ及其上游序列的启动子活性似乎不依赖于SP1蛋白。

The sequence of the human PrP gene Exon Ⅰ and its upstream segment has promoter-like activity

SUN Xianfeng, DONG Xiaoping, ZHOU Wei

(Institute of Virology,Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052, China)

【Abstract】ObjectiveThe human PrP gene locates at the short-arm of the 20^th chromosome. This article is was to map the promoter that transcribes the human PrP gene. MethodsThe sequence of the human PrP gene Exon Ⅰ and its upstream segment were amplified using PCR, and inserted into a CAT reporter plasmid pBL-CAT6 after sequence analysis. The values of the relative CAT expression under the control of this fragment were evaluated after transiently transfected into HeLa, COS7 and Sh-sy5y cell lines. The amounts of transcription activator SP1 in these three cell lines were calculated with band-shift assays. ResultsAnalysis of the human PrP gene Exon Ⅰ and its upstream segment showed a GC-rich sequence, with several potential SP1 binding sites, but without any TATA-box. Under the control of this fragment, the CAT expressions were 2-3 folds increased in transient transfection. Quantity band-shift assays revealed that SP1 was enriched in HeLa cells, but undetectable in COS7 and Sh-sy5y cells. ConclusionThe sequence of the human PrP gene Exon Ⅰ and its upstream segment functions as a promoter-like sequence, probably being as a weak TATA-less promoter. Cells derived from different tissues contain different amount of SP1. The activity of this promoter-like sequence seems to be independent of SP1 presence.

【Key words】PrP gene;Promoter regions(genetics);Transcription,genetic;Transfection

克-雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease,CJD)又称可传播性海绵样脑病(Transmissible spongiform encephalopathies,TSE)或朊病毒病(Prion disease)，是一类涉及中枢神经系统的退行性脑病。其致病因子目前被认为是朊蛋白(Prion or PrP)。正常人的朊蛋白被证实是由细胞PrP基因编码产生，其基因位点位于20号染色体短臂^〔1〕。正常的朊蛋白与致病性朊蛋白具有相同的氨基酸序列，其空间结构发生变化后由正常的以α螺旋为主的结构(PrP^C)转变为异常的以β片层为主的结构(PrP^Sc)。这种病变的PrP^Sc沉积在脑组织中，引起神经系统的病理变化，导致临床症状的出现^〔2〕。同时，出现的PrP^Sc还可促使正常的PrP^C转变为致病的PrP^Sc〔3〕。

研究显示，不同组织来源的细胞中朊蛋白的表达程度差异很大，主要出现于神经细胞中^〔4，5〕。细胞间朊蛋白表达的差异提示在朊蛋白表达的控制区域可能存在着组织特异性的调节单位。目前对PrP启动子及其调控区域的研究甚少。本实验从人外周血白细胞中扩增出人PrP基因外显子Ⅰ及其上游序列，对这段序列的进一步检测发现具有启动子样活性。同时还证实在神经细胞中细胞转录增强子SP1的含量较上皮类细胞明显为低，PrP启动子样序列的活性似乎不依赖于SP1。

1材料和方法

1.1PCR扩增PrP外显子Ⅰ及其上游序列^〔6〕的引物由上海生工公司合成，p1：GGC/CGG/CCG/CCC/GCC/GCG/GGG；p2：CTG/CCT/CGG/TCG/TGA/GGA/GAG。提取人白细胞DNA，1 μg模板DNA与2.5 U pwo polymerase(Boehringer Mannheim公司产品)，200 μmol/L dNTP，1 μmol/L的引物进行PCR反应，反应条件为97℃ 1 min，65℃ 1 min，72℃ 1 min，共35个循环。

1.2质粒构建PCR产物在T₄DNA磷酸激酶(Promage公司产品)的作用下进行末端磷酸化，与pUC19 Hinc Ⅱ酶切片段连接，转化大肠埃希菌XL1-blue。经过酶切鉴定(Hind Ⅲ, BamH Ⅰ和Nar Ⅰ，Hind Ⅲ)后选出正向克隆的质粒命名为pUC-p。重组质粒中的插入片段用ABI377自动分析仪测序。以Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切pUC-p，游离回收插入片段，定向克隆至质粒pBLCAT6相应位点，构成质粒pCAT6-p。

1.3细胞培养及转染COS7、HeLa、sh-sy5y细胞系在含10%小牛血清的DMEM(GIBCO BRL公司产品)培养液中生长。细胞生长至70%～80%时采用磷酸钙法转染^〔7〕，简述如下：4 μg质粒DNA，1.6 μg pCMV-Lac-z DNA 与15 μl 2mol/L氯化钙，150 μl 2×HBS液(280 mmol/L NaCl，10 mmol/L KCl，1.5 mmol/L Na₂HPO₄，12 mmol/L葡萄糖，50 mmol/L HEPES)，室温作用20 min，缓慢滴加至单层培养细胞。

1.4CAT表达量的检测转染48 h后收获细胞。离心沉定细胞，用0.35 ml裂解液(CAT ELISA试剂盒提供)悬浮，室温作用10 min。反复冻融3次，3 000 r/min离心10 min，收集上清。取200 μl用CAT ELISA试剂盒(Boehringer Mannheim公司产品)检测CAT表达量，405 nm光波下测吸光度A值。取100 μl加50 μl 4 mg/ml ONPG(SIGMA公司产品)，37℃水浴1 h，在420 nm光波下测β-gal的A值。

1.5细胞蛋白提取与浓缩分别收集培养3～5 d的上述三种细胞，离心去上清。沉淀用100 μl PBS悬浮，反复冻融3次，3 000 r/min 离心10 min，取上清。经浓缩离心管(Pall Filtron公司产品)浓缩，蛋白质定量试剂(Bio-Rad公司产品)定量，-70℃保存。

1.6条带移动实验oligo-SP1为40 bp的人乳头瘤病毒(Human papilloamvirus,HPV)16型双链DNA(nt 7 836-7 875)，其含有DNA结合蛋白SP1的结合位点^〔8〕。探针标记采用末端标记法，2 μg oligo-SP1、10 μCi γ-³²-P-ATP、5 U T4 DNA 磷酸激酶，37℃作用1 h。酒精沉淀干燥，溶于50 μl的TE中。10 μg细胞提取物与0.5-2 μl³²P标记的oligo在300 μg/ml牛血清白蛋白、5 μmol/L DTT、10 μmol/L亚精胺和0.5～1.0 μg dIdC的条件下室温反应30 min。反应结束后进行5%的非变性PAGE胶电泳，真空干胶后放射自显影。条带移动实验的竞争抑制实验所用的竞争物oligo-HPV18-WT(5′-AGC/TTA/GGG/AGT/AAC/CGA/AAA/CGG/TA-3′)为HPV18 DNA序列。oligo-T7(5′-TCGATAATACGACTCAC

TATAGGGAGAGATC-3′)为T7启动子序列。与³²P标记的oligo反应之前，HeLa细胞提取物先与50及400倍的未标记竞争oligo反应20 min。

2结果

2.1人PrP外显子Ⅰ及其上游序列以提取的正常人外周血白细胞DNA为模板扩增出203 bp的PrP外显子Ⅰ及其上游序列。其核苷酸序列结果见图1。此序列与Puckett报道的人PrP基因外显子Ⅰ及其上游序列^〔6〕相比较，同源性为90.8%。对这段序列进一步分析未发现有TATA盒结构存在，但GC含量高达79.8%，同时含有3个CCGCCC序列。这一结构为细胞转录因子SP1的结合位点。

图1人PrP基因外显子Ⅰ及其上游核苷酸序列

Fig.1The nucleotide sequence of the human PrP gene

Exon Ⅰ and its upstream segment

2.2人PrP外显子Ⅰ及其上游 序列具有启动子样活性将构建的带有人PrP外显子Ⅰ及其上游序列的CAT报道质粒分别瞬时转染COS7、HeLa、Sh-sy5y 3种细胞系，进行CAT表达值测定。与空载体pBLCAT6 CAT检测结果相比，人PrP外显子Ⅰ及其上游序列在HeLa细胞、COS7细胞和Sh-sy5y细胞中分别可诱导产生2.0、3.0及2.5倍的CAT表达增强(图2)。这提示此段序列可能具有弱的启动子样功能。

图2人PrP基因外显子Ⅰ及其上游序列具有启动子样活性

Fig.2The sequence of the human PrP gene Exon Ⅰ and its

upstream segment has promoter-like activity

1:HeLa cells. 2:Sh-sy5y cells. 3:COS7 cells. The values

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