胶质细胞源神经营养因子(GDNF)是近几年来发现并克隆成功的一种新的神经营养因子，它对不同神经元的生长、发育过程都有重要的影响^〔1-3〕。GDNF对中脑多巴胺能(DA)神经元具有存活、支持作用，对损伤的DA能神经元具有修复作用^〔4，5〕。GDNF除对DA能神经元有特异性营养作用外，还对胆碱能神经元、去甲肾上腺素能神经元、运动神经元及外周神经系统的各类感觉神经元、交感神经元等均有很强的营养作用。GDNF对6-羟基多巴(OHDA)及神经毒MPTP损伤的黑质纹状体多巴胺能神经元有保护及修复、再生的功能。甚至黑质多巴胺能神经元通向纹状体的神经纤维被切断后加入GDNF能使绝大多数该类神经元免于死亡。GDNF对Parkinson′s(PD)和Alzheimer′s(AD)病的预防和治疗作用在于减慢DA能神经元退变过程，并使残存的DA能神经元轴突增生而增加功能活性以补偿退变的神经元^{〔1，4，6〕}。因此，PD大鼠模型动物脑内注射GDNF可明显改善其行为缺陷^〔4，6〕，应用GDNF可延缓神经元退变过程，减轻各种原因造成的神经系统损伤^〔7-9〕。由于GDNF在体内表达水平很低，难以从组织中提取，因此，必须采取基因工程手段克隆中国人自己的GDNF基因，构建高效表达载体以获得具有生物学活性的可溶性的非融合蛋白，为研究治疗PD、AD、ALS提供更多的途径。

1材料和方法

1.1酶及载体限制性核酸内切酶、

Sepharose-6B-heparin等购自华美生物工程公司。高效表达载体PBV220由病毒学研究所基因工程室赠送。

1.2GDNF引物设计GDNF mRNA成熟肽端缺乏起始密码子，为获得纯天然非融合蛋白，在上游引物设计时加入起始密码子ATG。5′端引物：TAGGATCCATGTCACCAGATGAACA

AATGGCA，3′端引物：GCAAGCTTCAG

ATACATCCACACCTT；5′和3′端引物分别引入酶切位点BamH Ⅰ和Hind Ⅲ。

1.3RT-PCR扩增GDNF cDNA从人胶质细胞瘤组织中提取总RNA，按Promega试剂盒推荐方法，35个循环获得GDNF cDNA，该片段经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切纯化备用。

1.4酶切图谱分析重组GDNF质粒碱法提取pBV220，用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶解后纯化出pBV220大片段，加入GDNF cDNA片段，T4 DNA ligase等连接反应过夜，连接反应液转化大肠埃希菌TG1，挑取阳性转化子进行扩增，再纯化出重组GDNF质粒，用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ消化分析重组质粒相对分子质量大小。

1.5重组质粒的表达与纯化重组GDNF质粒在TG1中大量扩增，收获工程菌超声破碎离心，取其上清进行Sepharose-6B-heparin亲和层析，用0.15～1.5 mol/L NaCl,50 mmol/L PBS(pH8.0)连续梯度洗脱，收获A(280 nm)洗脱峰，置PEG浓缩至所需体积。用Bradford法定氮^〔10〕。以15% SDS-PAGE考染分析重组GDNF相对分子质量。

1.6重组GDNF生物学活性分析解剖镜下挑取9 d龄鸡胚背根神经节对不同浓度GDNF(50，100，200，400 ng/ml)测其生物学活性。96孔“U”板，每孔加入RPMI1640 25 μl，神经节一个，不同浓度重组GDNF 25 μl，鸡血浆25 μl，凝血酶25 μl，阴性对照补加RPMI 1640 25 μl。置5% CO₂孵箱37℃培养36～72 h判定结果。

2结果

2.1RT-PCR扩增结果按Promega试剂盒推荐方法从人胶质瘤组织中提取总RNA，经RT-PCR 35次循环后，1.4%PAGE显示PCR产物约405 bp的特异性扩增条带。

2.2重组人GDNF高效表达载体组建与酶切图谱鉴定pBV220和PCR产物GDNF基因分别经BamH Ⅰ、Hind Ⅲ消化后再纯化出所需片段，加入连接酶连接过夜，转化大肠埃希菌扩增，纯化出rhGDNF DNA,用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ双酶解鉴定证明插入片段与预计大小一致(图1)。

1～7：重组GDNF DNA约405 bp；8，9：marker

1重组GDNF质粒酶切图谱鉴定

Fig.1Restriction map of recombinant human

GDNF plasmid

1-7:Recombinant human GDNF DNA of

405 bp;8:Marker; 9:700 bp

2.3重组GDNF的纯化与鉴定收获培养液，超声破碎离心，上清过亲和层析柱连续梯度洗脱，收集洗脱峰，经Bradford法测其蛋白质含量约4 mg/L 15%SDS-PAGE显示GDNF单体的相对分子质量约15 000，见图2。

图215%SDS-PAGE测定rhGDNF

相对分子质量

Fig.2Molecular weight of rhGDNF

measured by 15% SDS-PAGE

S:rh GDNF. M: Molecular weight marker

2.4重组GDNF的生物学活性测定结果以50～400 ng/ml重组GDNF用于背根神经节均显示促神经节纤维生长作用，以200 ng最强，50 ng减弱，400 ng则出现对神经节纤维生长的抑制作用，结果见图3。

3讨论

重组GDNF工程菌在超声破碎时加入PMSF经亲和层析显示单一洗脱峰，而不加PMSF约在0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl时出现两个洗脱峰，PAGE显示前者为一条带，后者为两条带，大带相对分子质量同前者约15 000，小带14 000，各带均对DGR显示出生物学活性。因此，认为在无PMSF时出现的14 000带可能系15 000 GDNF被某种蛋白酶降解所致。

文献报道重组GDNF在原核表达系统为不溶性包涵体蛋白，需要恢复天然折叠状态才具有生物学活性，而活性要低于可溶性蛋白10～50倍。本文报道的重组GDNF为可溶性蛋白组分，不需重新折叠即对DGR有明显的促生长作用。重组GDNF基因全序列测定与文献^〔2〕比较显示第344位A变为G，即由原来的天门冬氨酸变为甘氨酸；单一碱基改变并未引起GDNF理化性质改变，仍然具有较强的生物学活性；这或许因为改变的碱基靠近羧基末端；本文所示的碱基改变也可能由于GDNF cDNA来源于非正常组织或是PCR技术本身还是种族不同造成，其确切原因有待进一步探索。本文组建的高效表达载体在一升大肠杆菌中可表达约4 mg可溶性蛋白质，使在实验室大量获得纯化GDNF产品成为可能，使应用GDNF成为研究治疗帕金森氏病、早老性痴呆等神经系统退行性疾病的有效途径。

A：阴性对照.B：200 ng rhGDNF

3重组GDNF促鸡胚背根

神经节生长状况

Fig.3Promoting growth of chicken embryo

DGR by recombinant human GDNF

A:Negative control. B:200 ng of rh GDNF

该课题为北京市科学技术委员会重点项目

参考文献

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