关键词: HIV-1；病毒抑制物；硫酸酯化箬叶多糖(S-ITPS)

【摘要】目的探讨硫酸脂化箬液多糖(S-ITPS)抗HIV的机制，为进一步开发该药提供理论依据。方法于病毒接种前，接种同时及接种后分别在培养细胞(MT-4)中加入硫酸脂化箬叶多糖(S-ITPS)，在S-ITPS存在或不存在的条件下培养1～4周。终点以病毒半数感染量(TCID₅₀法)，细胞病变(CPE)，MTT染色细胞保护率(MTT法)及培养上清中的p24抗原滴度(ELISA法)作为评价指标，判断药效，分析抗病毒靶位。结果S-ITPS在细胞无毒浓度作用下(＜1 250 μg/ml)可以有效地保护病毒感染细胞，使其不产生病变(IC₅₀=10 μg/ml)，并能抑制病毒复制(IC₅₀=156 μg/ml)。在S-ITPS存在下产生的少量病毒的感染性较对照组显著降低。动态观察结果表明：随着培养时间的延长，S-ITPS对病毒复制的抑制作用也增强。在培养的第1，2，3，4周，对病毒复制的抑制率分别为73.7%，63.5%，87.7%和95.4%。实验还显示S-ITPS可以抑制病毒吸附，但用药物预处理的细胞不能阻断病毒感染细胞。S-ITPS对游离病毒也有灭活作用。结论S-ITPS的抗病毒作用靶位在于阻断病毒吸附和抑制感染细胞中病毒的复制。对细胞病变的抑制作用强于对抗原合成的抑制，提示它不仅对病毒蛋白质合成有抑制作用，而且对病毒及其蛋白的病毒效应(如细胞病变)也有抑制作用。

Mechanism of Se-Indocalamus tessdatus polycassine(S-ITPS) agacnst human immunodeficiency virus type 1(HIV-1)

JIANG Yan

（The Enter for AIDS Prevention and Control, ）

CHENG Chunying, PEI Lijian, et al.

（Chinese Academy of Preventive Medicine,Beijing 100050, China）

【Abstract】ObjectiveTo study the mechanism of Se-Indocalamus tessdatus polycassine(S-ITPS) against HIV-1 and to provide a theoretical support for developing the anti-HIV drugs.MethodS-ITPS was added to MT-4 cells before viral inoculation,at the same time of viral inoculation and after viral inoculation, then the cells were cultured with or without S-ITPS for 1-4 weeks, finally, cytopathic effect(CPE),MTT staining method for viable cells (MTT assay),p24 antigen titer (ELISA),or infectivity(TCID₅₀ assay)of the cultural supernatants were used as markers to monitor the virus growth.ResultsS-ITPS can inhibit HIV-induced CPE(IC₅₀=10μg/ml)and viral replication (IC₅₀=156 μg/ml)in dose dependent manner.The virus infectivity in the presence of S-ITPS was greatly decreased than that of the control.The virus inhibition was enhanced under the presence of noncytotoxic drug concentration of ＜1 250 μg/ml in cell culture, inhibition of viral replication by S-ITPS was 73.7%, 63.5%, 87.7%and 95.4% at week 1, week 2, week 3 and week 4 of cultured cells respectively. It can also inhibit absorption of HIV-1 to MT-4 cells, but no inhibition of HIV-1 was seen when MT-4 cells were pretreated with S-ITPS. Virus can be inactivated by the agent also.ConclusionS-ITPS is an potent anti-HIV-1 agent in MT-4/HIV-1 cultural system,at least two mechanisms were in cluded:inhibition both of HIV-1 abborption to MT-4 cells and viral replication in HIV-infected cells.S-ITPS inhibition of CPE is stronger than that of p24 antigen production.

【Key words】HIV-1; Virus inhibitors; Se-Indocalamus tessdatus polycassine(S-ITPS)

关于硫酸酯化多糖的抗HIV-1作用，已经有很多报道^［1～8］。由于这一类药物不仅可以抑制病毒复制，而且具有明显的免疫调节作用，因此越来越多地受到研究者和药物开发者的关注。国际上已经有一些研究进入了动物^［8］和临床试验阶段^［9，10］，结果表明病人对此类药物有良好的耐受性。国内在本领域的研究尚处于起步阶段。充分利用国内的自然资源，积极发展抗艾滋病的药物将有利于中国和广大的发展中国家(拥有全球90%以上的HIV感染者)HIV感染者的生存。过去，我们筛选了多种中草药和植物，发现了一些有苗头的提取物。硫酸酯化箬叶多糖(Se-Indocalamus tessdatus polycassine,S-ITPS)是初筛有效的提取物之一，是从禾本科植物箬竹(Indocalamus tessdatus)的叶——箬叶中提取的多糖经硫酸酯化后得到的一种新型多糖产物。其相对分子质量为18.3×10⁴，具有多分支结构，主链由α（1-3）连接的木糖和β(1-6)半乳糖构成，侧链由阿拉伯糖和葡萄糖醛酸组成，葡萄糖醛酸主要位于分子的末端^［11］。我们初步研究了它的抗病毒机制，结果报告如下。

1材料与方法

1.1药物S-ITPS由中国科学院高能物理研究所陈春英博士提供。以pH7.2 PBS溶解S-ITPS，配成10 mg/ml，彻底溶解后，经0.22 μm微孔滤模过滤除菌，分装，4℃保存，用时以RPMI-1640培养基稀释至使用浓度。

1.2试剂MTT(Thiazoll Blue,噻唑蓝)购自Sigma公司。p24试剂盒购自美国Organon Teknika公司，产品号59518。

1.3细胞MT-4细胞悬浮在RPMI-1640培养基中。培养基中含有10%胎牛血清，青霉素和链霉素(100U/ml)。细胞的终浓度为3×10⁵/ml。使用时，以RPMI-1640洗净，用新鲜培养基再悬浮后用于实验。

1.4病毒实验毒株的制备^［12］：HIV-1(SF₃₃)为卫生部艾滋病预防与控制中心保存毒株。以HIV-1(SF₃₃₎感染MT-4细胞，5天后收集上清，离心(3 000r/min)，上清经0.22 μm微孔滤模过滤，分装，液氮冻存。待用。

病毒滴度的测定：以TCID₅₀表示病毒毒力。取上述制备好的毒株，做10倍系列稀释，10^-1至10^-10。将各稀释度的毒株接种于MT-4细胞，各3复孔，同时设阴性对照。37℃孵育6 d后，观察细胞病变(CPE)，以出现细胞病变的最高稀释倍数的倒数作为TCID₅₀。

1.5病毒抑制实验

1.5.1对病毒复制的抑制作用以200 TCID₅₀HIV-1(SF₃₃)攻击MT-4细胞(1×10⁶/ml)，细胞与病毒容积比为1∶1，37℃，孵育2 h，洗净，弃上清，将感染细胞再悬浮于培养基，在药物存在下培养1～4周，观察CPE，测定细胞活性(MTT法)，收集上清测定p24抗原(ELISA法)和病毒半数感染量(TCID₅₀法)。参见1.6。

1.5.2对病毒吸附的抑制作用在病毒感染细胞的同时加入药物，同时设阴性和阳性对照，4℃，孵育1 h，洗净，弃上清，去除未吸附的病毒和药物，将细胞再悬浮于培养基，37℃培养一周，进行各项指标的检测。方法同1.5.1。

1.5.3药物预处理的细胞对病毒感染的阻滞作用将细胞与药物在37℃培养72h，洗净，弃上清，去除药物，再将细胞暴露于病毒，37℃培养一周，观察CPE，测定细胞培养上清中的p24含量。

1.5.4对病毒的灭活作用感染性病毒(10⁴TCID₅₀)与S-ITPS(5 mg/ml)在室温下作用1min，然后，将病毒和药物的混合液离心(53 000 r/min，1h)，弃掉上清(含药物部分)，反复洗2次，最后将去除药物的病毒接种于1640培养液悬浮的MT-4细胞，在96孔板(1×10⁵／孔)中培养10d后，收取上清，-20℃冻存，待测p24。必须同时作相应病毒感染对照组，与实验组比较。计算病毒灭活率。灭活率(%)=［(感染对照组吸光度A值-实验组A值)÷感染对照组A值］×100%。

1.6疗效评价指标的检测方法

1.6.1CPE^［11］在显微镜下观察培养细胞的形态和发生病变的情况。CPE判断标准：75%以上细胞发生病变为+++；50%～75%细胞发上病变为++；25%～50%细胞发上病毒为+；25%以下发上病变为±；没有细胞病变为-。

1.6.2MTT法测定细胞存活率^［13］在96孔微量培养板中加入25 μl MTT(5 mg/ml)，轻轻混匀，置37℃孵育4h后加入100 μl 10%SDS,轻轻混匀，30～60 min内在550酶标仪上(570/650 nm)读取A值。计算细胞存活率。细胞存活率(%)=(样品组A值/正常对照组A)×100%。

1.6.3ELISA法检测p24抗原按照试剂盒的说明进行(美国Organon Teknika公司，产品号59518)。

1.6.4TCID₅₀法测定病毒毒力收集培养上清，做10倍系列稀释，将不同稀释度的上清分别接种于正常MT-4细胞，培养一周，观察细胞病变，收集上清，测定p24，确定TCID₅₀。参见1.4。

2结果

S-ITPS在对细胞最大无毒浓度下(1 250 μg/ml)可以有效地保护病毒感染的细胞，使其不产生病变(IC₅₀=10μg/ml)，使培养细胞100%存活，对病毒复制也有较好的抑制作用(IC₅₀=156 μg/ml)(表1)。在药物存在下培养的感染细胞上清中虽然可以测定到抗原，但病毒的感染性比对照组显著降低，而且