关键词: 正粘病毒A型，人；血凝素；神经氨酸酶；基因

【摘要】目的研究新分离到的H1N2亚型毒株血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因的来源。方法病毒通过鸡胚增殖后提取其RNA，通过逆转录合成cDNA，经PCR扩增和产物纯化，用双脱氧链终止法进行核苷酸序列测定，并用MegAlign(1.03版)和Editseq(3.69版)软件进行种系发生学分析。结果新分离到H1N2毒株HA1区氨基酸序列与A/PR/8/34(H1N1)和A/Guangdong/6/91(H1N1)毒株间的同源性分别为98.2%和99.4%；NA蛋白分子氨基酸序列与1995年的甲3(H3N2)亚型毒株间同源性高达99.1%。结论新分离的H1N2毒株是A/PR/8/34(H1N1)类毒株与甲3(H3N2)亚型毒株通过基因重配而来。

Study on the origin of influenza A(H1N2) virus HA and NA genes

Qi Junlin, WANG Min, DONG Jie, et al.

（Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052）

【Abstract】ObjectiveTo determine the origins of the HA and NA genes of new subtype (H1N2) of influenza A virus. MethodsVirus was amplified in embryonated chicken eggs, then virion RNA was transcribed into cDNA by reverse transcriptase, cDNA amplified by PCR, the products of PCR were purified. Afterward, RNA sequence analysis was performed by the dideoxynucleotide chain termination method, using synthetic oligodideoxynucleotide primers. Finally, phylogenetic analysis of the sequencing data was performed with MegAlign (Version 1.03) and Editseq (Version 3.69) softwares. ResultsThe homology of amino acid sequences of protein molecules on HA1 domains when compared, with A/PR/8/34(H1N1) and A/Guangdong/6/91(H1N1) viruses was 98.2% and 99.4%, respectively. The homology of amino acid sequences of NA protein molecules between the novel reassortant and H1N1 virus was only 83.4%, but the homology of those between H1N2 strain and H3N2 virus circulating in men in 1995 was as high as 99.1%. ConclusionThe new reassortant(H1N2) virus HA gene was derived from A/PR/8/34(H1N1) like virus, but its NA gene was derived from H3N2 virus circulating in men in 1995.

【Key words】Influenza A virus,human; Haemagglutinin; Neuraminidase; Genes

甲型流感病毒曾造成多次世界性流感大流行，给人类带来了深重的灾难。但流感病毒大流行株起源至今尚未弄清，仍存在着种种不同的看法。有人认为，流感病毒大流行株是人与禽流感病毒通过基因重配而来^［1］。1977年，H1N1亚型流感病毒在人群中消失20年后又重现^［2］，它的基因组与50年代在人群流行的H1N1亚型毒株极为相似^［3］，显然它的重现很难用重配学说来加以解释。然而，它的重现给了解不同亚型流感病毒是否能在人群中发生基因重配带来了良机。自1977年以来，人群中同时流行着两个亚型(H3N2和H1N1)毒株。而后，确实国内外学者相继报道了人群中分离出H3N2和H1N1病毒的基因重配株^［4～9］。由于人群对这些重配株普遍存在有不同程度的免疫力，故它们均未能在人间造成流感流行。

1996年，我们在流感监测中又分离出了3株H1N2亚型流感病毒。出乎意料的是，它们的血凝素蛋白抗原性类似于A/PR/8/34(H1N1)毒株^［10］。据我们所知，这样的重配株属国际上首次发现，这个发现对弄清流感病毒抗原性变异规律，尤其大流行株起源具有重要的意义。故有必要弄清新分离出H1N2亚型毒株的基因来源。下面报告其HA和NA基因来源的研究结果。

1材料和方法

1.1病毒A/太铁/26/95(H1N2)、A/太铁/41/95(H1N2)和A/太铁/42/95(H1N2)系于1995年12月至1996年3月分别从12，12和36岁三名流感患者中分离出，经9～10 d龄鸡胚尿囊腔接种增殖，所收获的新鲜尿囊液为实验用病毒。

1.2病毒粒RNA提取按德国1995年出品的RNeasy RNA kit,QIAquick^TM Handbook所提供的方法。

1.3cDNA合成聚合酶链式反应见文献［11］。

引物：用于HA基因，cDNA合成和PCR扩增及序列测定的有：6(5′ d-AAGCAGGGGAAAATA-AAA)，282(5′d-CTGCTTCCAGTGAGAT CAT)，505(5′d-TTTACAGAAATTTGCTATGG)，792(5′d-ATAATATT TGAGGCAAATGGA)，1193R(5′d-GTAATCCCGTTAATG GCA)；用于NA基因，cDNA合成和PCR扩增及序列测定的有：14(5′d-GTGAAGA TGAATCCAAATCAA)，106(5′d-GGTA-ACTACGTTAACATTGCA)，372(5′d-GAGAACCTTATGTGTCATGCG)，695(5′d-CAGGAGTCGG AATGCGTTTGT)，823(5′d-GTCAGGAAGTGC-TCAGCA)，1063(5′d-AGTGAAAGGCTGG-GCCTT)，1420R(5′d-GCGAAAGCTTATATAGGC)。

所有引物由国家流感中心提供。³⁵S-ATP，逆转录酶，PCR试剂盒，PCR产物纯化试剂盒及Sequence system试剂盒均由美国疾病控制中心提供。

1.4PCR产物纯化按德国出品的QIAquick PCR Purification kit所提供的方法。

1.5核苷酸序列测定采用双脱氧链终止法^［12］，基本步骤按USB公司DNA sequence试剂盒所提供的方法。

1.6核苷酸序列分析用DNA STAR公司出品的序列分析软件，MegAlign(1.03版)和Editseq(3.69版)。A/Beijing/262/95(H1N1)的序列由美国疾病控制中心提供，其它序列由国家流感中心提供。

2结果

2.1血凝素基因核苷酸序列测定和分析由于流感病毒HA轻链(HA2)区很保守，而重链(HA1)区具有易变性。前言中已提到，新分离出的H1N2毒株HA蛋白的抗原性类似于A/PR/8/34(H1N1)病毒。故对三株H1N2病毒的HA1区基因核苷酸序列进行了测定，并将测定结果推导出氨基酸序列，然后，与一些甲1亚型毒株进行比较，见图1。

“-”为糖基化位点

13株H1N2毒株与A/PR/8/34(H1N1)类毒株，当时流行H1N1毒株及以往发现的H1N2毒株HA1区蛋白分子上氨基酸序列比较

Fig.1Deduced amino acid sequences of the HA gene HA1 region of the three novel H1N2 viruses compared with those of H1N1 and H1N2 viruses

Note:The amino acid sequences of the HA1 protein molecule of all the comparing viruses compared were provided by the National Influenza Center of China. “-”means the essential glycosylation site

图1表明：测定和比较毒株HA1基因均编码328个氨基酸，有共同的6个糖基化位点，HA1与HA2连接处均为一个精氨酸(R)；3株H1N2毒株HA1蛋白分子上见不到有氨基酸序列的差异；而H1N2与A/PR/8/34(H1N1)毒株间有6个位点不同，分别位于83(V-A)，131(S-N)，197(D-E)，201(I-L)，213(T-S)和262(R-W)，其同源性为98.2%(322/328)，然而，与A/Guangdong/6/91(H1N1)毒株间仅有两个差异：131(S-N)和262(R-W)。其同源性高达99.4%(326/328)。这些差异中除131和197分别位于A和B抗原决定簇区外，其余均位于非抗原决定簇区。

同时，图1还表明三株H1N2病毒HA1区氨基酸序列与当时人群中流行的甲1(H1N1)A/北京/262/95及以往发现的H1N2亚型毒株A/哈防/1/88的同源性仅分别为83.4%和84.0%。

2.2神经氨酸酶基因核苷酸序列测定和分析对3株H1N2病毒NA基因全序列进行测定并推导出其氨基酸序列。然后，与以往发现的H1N2亚型毒株A/Harbin/1/88和A/Harbin/12/92及1992～1995年的一些H3N2亚型毒株进行比较和分析，结果见图2。

“-”为糖基化位点

23株H1N2毒株与当时流行H3N2毒株及以往发现的H1N2毒株NA蛋白分子上氨基酸序列比较

Fig.2Deduced amino acid sequences of the NA genes of the three novel H1N2 viruses compared

with those of previous H1N2 viruses and H3N2 viruses circulating in men recently

Note:the amino acid sequences of the NA protein molecule of previous H1N2 viruses and the H3N2 viruses were provided by the National Influenza Center of China. “-”means the glycosylation site

图2表明：测定和比较毒株NA基因均编码469个氨基酸，除两株旧的H1N2毒株仅有7个糖基化位点(少一个329～331位)外，其余的都有共同的8个糖基化位点。3株H1N2毒株NA蛋白分<