关键词: 肝炎，丙型；肝炎病毒，丙型；基因，免疫球蛋白；基因，结构，病毒；序列分析

【摘要】目的研究丙型肝炎病毒非结构区3(Hepatitis C virus nonstructurd region 3, HCV-NS3)与丙型肝炎发病的关系，寻求一种可用于判断临床干扰素(Interferon,IFN)治疗疗效的检测方法。方法采用基因重组，经大肠埃希菌表达，提取HCV-NS3不同末端蛋白作为抗原，并回顾性的对IFN治疗的63例HCV-RNA阳性的丙型肝炎患者血清用免疫印迹(Western blot)方法，进行了相应抗体检测。结果证实HCV-NS3不同末端抗体在丙型肝炎患者，特别是慢性丙型肝炎患者，与IFN治疗疗效关系密切。结论通过测定HCV-NS3不同末端抗体的方法有可能对丙型肝炎，特别是慢性丙型肝炎患者的IFN治疗效果进行评价，为预测疗效提供了一个新的手段和依据。

Preparation of hepatitis C virus nonstructural region antigens and detection of their relative antibodies

PENG Xiangxin

（Department of General Internal Medicine, China-Japan Friendship Hospital, Beijing, 100029, China）

WANG Qinhuan

【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between HCV NS3 and the pathogenesis of HCV and research a method to assess the therapeutic effect of interferon (IEN) in clinicl.MethodsIn a retrospective research,we used HCV-NS3 antigens of different terminals expressed in E. coli. in which contained the recombinant plasmids involving amino terminal region (N′) or carboxyl terminal region(C′) of HCV-NS3, to detect the antibodies by Western blot in sera of 63 hepatitis C patients who were treated with IFN.ResultsIt proved that antibodies against HCV-NS3 N′ and/or HCV NS3 C′ terminals in hepatitis C patients may predict the treatment result of IFN, especially in the patients with chronic hepatitis C.ConclusionThe detection of antibodies against HCV-NS3 N′ and/or C′ terminals may be used for evaluation of IFN treatment, especially in chronic hepatitis C ones.

【Key words】Hepatitis C; Hepatitis C virus (HCV); Gene, immunoglobulin; Genes, structural, viral; Sequence analysis

丙型病毒性肝炎(以下简称丙型肝炎)与乙型肝炎相比，由于在临床上常具有无明显症状和体征，易于形成慢性感染，肝硬化、肝癌发生率高等特点，而受到广泛重视。为了提供更好的指导诊断治疗和评价预后的方法，检测手段不断问世，如：测定抗-HCV的酶联免疫法(EILSA)，反映病毒复制状态的HCV-RNA多聚酶链反应(PCR)和基因分型、病理等各种方法，在临床早期诊断和献血员筛选方面有一定的应用价值。但在用于药物疗效和疾病预后判断方面仍不尽人意。

丙型肝炎病毒非结构区(HCV-NS3)是HCV基因组中较特殊的一个部分，它可编码不同功能的蛋白质，具有多种酶活性。在HCV复制中起重要作用。与丙型肝炎发病与复发密切相关。由于HCV-NS3不同末端的抗体，目前尚无检测的试剂盒，故应用分子生物学方法，分别将HCV-NS3氨基末端(N′)和羧基末端(C′)片段进行重组。利用在大肠埃希菌中所表达的相应蛋白作为抗原，检测血清中相应抗体，来探讨其与干扰素(Interferon,IFN)治疗疗效及预后关系。

1材料和方法

1.1主要试剂和材料限制性内切酶、pGEX(美国Promega公司)；pGEX Sepharose 4B试剂盒(瑞典Pharmacia公司)；大肠埃希菌JM109，BL21(日本TOYOSO公司)；牛小肠碱性磷酸酶(CIP)、蛋白分析液、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国Bio-Rad公司)；丙氨酸转氨酶(ALT)试剂盒(日本HITACHI公司)；HCV-RNA PCR试剂盒(中国军事医学科学院)

1.2HCV-NS3抗原制备

1.2.1重组质粒DNA^［1］采用pGEX-1λT表达载体，在多连接位点插入HCV-NS3片段。PCR扩增含有HCV-NS3 cDNA N′和HCV-NS3 cDNA C′的DNA片段，HCV-NS3 cDNA N′从3 354～4 210 bp，含pET 87 bp起始编码ATG和21 bp的终止编码TGA。HCV-NS3 cDNA C′从4 116～5 147 bp。引物序列如下：

NS3 cDNA N′：N1.5-CGGGCACGTTGTAGGCA-TC-3′

N2.5′-AACGGACGGCTTTAGGACGA-3′

NS3 cDNA C′

C1.5′-TGGGTACCTTATGGCAAGTTCCTCGCCGG-3′

C2.5′-TAGAATTCTACCAGTCCTACCTCGCCGCTG-3′

94℃1 min，55℃2 min，72℃3 min。40个循环。低融点琼脂糖电泳中回收HCV-NS3 cDNA N′和HCV-NS3 cDNA C′片段。限制性内切酶 XbaⅠ和EcoRⅠ处理DNA片段，插入pGEX-1λT载体。导入感受态大肠埃希菌JM109。转种于含氨苄青霉素LB培养基，37℃温箱12～16 h。筛选阳性克隆。用碱裂解法提取重组质粒。用限制性内切酶酶切图谱确定插入方向。

1.2.2HCV-NS3抗原制备将含有正确表达方向的重组质粒，接种于含大肠埃希菌BL21 LB培养基，IPTG诱导重组质粒产生HCV-NS3 N′和C′蛋白。按pGEX Sepharose 4B蛋白纯化试剂盒说明书操作，纯化蛋白。10% SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)，测定抗原性。电泳2～3 h。凝胶考马斯亮蓝染色，并转移至PVDF膜与标准的HCV-NS3抗体血清结合。

1.2.3抗原性鉴定用免疫印迹(Western blot)方法，检测含有蛋白抗原的PVDF膜，TENG-N液洗2次15 min/次［配方Tris (pH7.5) 50 mM,EDTA(pH 8.0) 5mM,NaCl 150 mM, 0.25%明胶，0.05% NP40］。加入已知抗HCV-NS3标准阳性血清。37℃1 h。TENG-N洗2次15 min/次。辣根过氧化酶标记羊抗人IgG抗体。37℃孵育，1 h。TENG-N洗2次，15 min/次。染色10 s［配方3，3-二氨基联苯胺20 mg,1M Tris (pH7.5) 4 ml, H₂O₂ 28 μl,H₂O 36 ml］。0.05 M HCl终止反应，10 s。

1.3病例选择根据1995年5月北京第五次全国传染病和寄生虫学术会议制定的《病毒性肝炎防治方案(试行)诊断标准》。选择丙型肝炎患者63例(男性54例，女性9例)。全部病例RT-PCR方法测定为HCV-RNA阳性。急性肝炎16例，慢性肝炎47例。63例患者中有输血制品史占87%，急性肝炎患者全部有输血制品史，慢性肝炎占60%。全部用IFN-α2α治疗，300万单位肌注连续3天后，隔日一次，总疗程3个月。

1.4丙型肝炎患者血清抗HCV-NS3 N′和C′检测免疫印迹法。方法同前，仅将标准血清换成待测的患者血清。

1.5抗HCV，HCV-RNA及ALT检测方法略。

1.6IFN治疗疗效判断标准停药6个月后追踪观察结果进行判断。完全反应：HCV-RNA阴性，ALT正常；部分反应：除完全反应和无反应以外的病例，ALT明显下降，HCV-RNA阳性；无反应：ALT高于治疗前或与治疗前相同，HCV-RNA阳性；复发：治疗结束时，ALT正常，HCV-RNA阴性，在随访的6个月内又出现ALT升高，伴有或不伴有HCV-RNA阳性。

1.7统计学方法卡方检验。

2结果

2.1重组前后pGEX DNA限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ酶切图谱，HCV-NS3见图1。HCV-NS₃ N′为965 bp,HCV-NS3 C′为1 031 bp。

pGEX1=pGEX+HCV-NS3N′pGEX2=pGEX+HCV-NS3 C′

1重组质粒pGEX BamHⅠ和EcoRⅠ内酶切签定

Fig.1Restriction identification of the recombinant plasmids pGEX

(pGEX₁/BamHⅠand EcoRⅠ,pGEX₂/BamHⅠand EcoRⅠ)

图1显示：BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后在琼脂糖电泳上的DNA条带。图中标记Marker1和Marker2分别为标准核苷酸λ/Hind Ⅲ digest和φ174/X HincⅡ digest。

2.2蛋白质表达和抗原性鉴定重组质粒转入大肠埃希菌BL21后，异丙基硫代-D-半乳糖苷(Isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)诱导产生相对分子质量为49 000和32 000二条增宽蛋白带。用已知抗HCV-NS3阳性标准血清测定。Western blot测定后的HCV-NS3 N′和C′蛋白抗原性，见图2。经二氨基联苯胺(DAB)染色在相应相对分子质量32 000和49 000区出现的蛋白条带。证实为HCV--NS3 N′和C′蛋白。

图2表达蛋白与HCV阳性血清的Western blot鉴定结果

Fig.2Western blot analysis of the expressed proteins with hepatitis C positive serum

2.3蛋白含量测定蛋白显色液加入所需测定的蛋白液中，放置15 min，在595 nm处测定A值，通过标准曲线计算蛋白含量，为42～45 μg/μl。

2.4血清中抗H