关键词: HIV-1；基因，gag；克隆，病毒；聚合酶链反应

【摘要】目的克隆和表达人免疫缺陷病毒(HIV)Ⅰ型中国株E、B亚型代表株的结构基因gag。方法在分子流行病学调查的基础上，选择1份经部分gp120基因测序判定为E亚型和1份经部分gp120基因测序判定为B亚型的代表性样品，利用套式聚合酶链反应(PCR)，扩增外周血中的前病毒，获得了结构基因gag全长片断，并先后克隆到plin8Pr55和pFastBacl载体中，我们首次克隆到全长的中国株E亚型gag基因。采用双脱氧链末端终止法测定全部DNA序列。采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统，构建了中国HIV-1 gag基因的杆状病毒表达质粒，得到了表达HIV-1E和B亚型gag的重组杆状病毒。结果克隆到的E、B亚型gag基因具有完整的阅读框架，无大的缺失和插入，gag重组杆状病毒感染昆虫细胞表达了由gag形成的病毒样颗粒，并分泌到上清中，Western blot显示感染的昆虫细胞表达相应的gag基因。超薄电镜显示用gag基因的重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞可形成病毒样颗粒，这些颗粒为空心的大约100 nm颗粒样物定位在胞内，明显不同于昆虫杆状病毒本身形成的颗粒。结论克隆到的E、B亚型代表株的gag基因具有完整的结构和功能，我们得到了针对我国HIV-1流行株的病毒样颗粒候选疫苗抗原。

Cloning and expressing of full-length Subtype E and Subtype B gag gene from uncultured PBMCs of HIV-1 infected individuals in China

ZHANG Hongtao

（AIDS Reference Lab Institute of Blood Transfusion, ）

SHAO Yiming, XIAO Yao, et al.

（Chinese Academy of Medical Sciences, Chengdu 610081, China）

【Abstract】ObjectiveTo clone and express subtype E and subtype B gag gene of the prevalent HIV-1 strain in China.MethodsOne HIV-1 positive sample, whose subtype had been determined as subtype E and one HIV-1 positive sample, whose subtype had been determined as subtype B by sequence analysis of partial env gene were chosen to be amplified by nested PCR. We got two full-length fragments of gag gene and incorporated them first into plin8Pr55 and then into pFastBacl.ResultsSequence analysis showed the cloned gag genes have the complete open-reading frames and have no major deletion and insertion. Using the Bac-to-Bac system, we obtained the recombinant baculoviruses containing gag genes. Western-blot analysis showed that insect cells infected with gag recombinant baculoviruses expressed HIV-1 gag antigen. Thin section electron microscopy showed that virus-like particles(VLPs) formed in insect cells was infected with gag.ConclusionThe cloning and expression of gag genes of the prevalent HIV-1 stains in China revealed that the cloned genes have intact structure and function and this paves the way for development of HIV-1 vaccines targeted at the epidemic of HIV-1 in China, also for study of biological functions of gag gene and development of diagnostic kits of HIV-1.

【Key words】HIV-1; Genes,gag; Clone; Viral; Polymerase chain reaction

在分子流行病学调查的基础上，我们克隆到中国艾滋病毒E、B亚型代表株的结构基因gag，为疫苗研制而设计的克隆路线是从未经培养的HIV-1阳性的外周血中直接扩增全长的gag，而以往的文献多集中于从培养病毒中克隆全长的gag和gp120基因^［1～3］。有文献^［1～3］表明，不论是从cDNA还是从前病毒DNA克隆获得的HIV-1的全长基因有一部分是缺陷的^［2，3］，因此，有必要选择合适的表达系统来表达所克隆的基因以初步判定所克隆的基因是否完整或缺陷。我们采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统，构建了中国HIV-1 gag基因的杆状病毒表达质粒，并利用GIBCO公司的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，得到了表达HIV-1E和B亚型gag的重组杆状病毒。gag重组杆状病毒感染昆虫细胞表达了由gag蛋白形成的病毒样颗粒，并分泌到上清中。

1材料和方法

1.1试剂及标本来源HIV-1阳性外周血为1996年分子流行病学调查收集的全血样品。1例全血样品取自广东，编号为GD008；有1例取自河南，编号为Hen48。经Env外膜蛋白的部分测序(C2-V3)，前1例判定为E亚型，后1例判定为B亚型。使用Qiqen公司QiaAmo Blood试剂提取细胞DNA，Taq酶及PCR试剂购自华美生物制品公司。质粒pFstBacl、CellFectin、致敏菌DH10Bac(含有杆状病毒基因组的大质粒-Bacmid及转座辅助质粒)均购自GIBCO公司。plin8Pr55为含有HBX₂gag基因的pUC18载体的衍生质粒，为参比实验室保存。T-easy Vector、dNTP、T4DNA连接酶、限制性内切酶和SP6、T7测序引物购自Promega公司。昆虫细胞株Sf9(Spodoptera frugiperida)和核多角体野毒株(AcMNPV)为参比实验室保存。昆虫细胞用含10%的TC-100培养液或Sf900-Ⅱ无血清培养液(购自GIBCO公司)于27℃孵箱培养。HIV-1阳性血清为本室保存。HRP标记的羊抗人IgG购自同正生物制品公司。

1.2克隆策略及引物设计gag克隆引物(内侧引物)的5′端引入限制性内切酶对(XbaⅠ/SalⅠ)以便于定向克隆。引物及其序列如下：GagL，在HBX₂定位687-706，5′-CGACGCAGGACTCGGCTTGC-3′；pol b,在HBX₂定位2577～2593，5′CCTGGCTTAATTTAC-3′；Gag-1，在HBX₂定位789～807，5′-GATACTCTAGAATTCGCCGCCACCATGGGTGC-GAGAGCGTCA-3′；QP6，在HBX₂定位2481～2494，5′-GCTCTAGATCGTCGACAGGTGTAG-GTCCTAC-3′。

1.3PCR反应及产物的克隆采用套式PCR法扩增HIV-1 gag全长基因，第1次扩增取5 μl PBMCs作为DNA模板，第2次扩增取5μl第1次扩增的产物作为模板。两次扩增反应条件相同，第一个循环为94℃ 30 s；94℃ 30 s，55℃，30 s，72℃2 min，共30个循环。最后72℃延伸4 min。扩增HIV-1全长gag，Gag L/pol b为外侧引物，Gag-1/QP6为内侧引物，扩增反应体系为50 μl。gag基因的PCR产物经XbaⅠ和SalⅠ双酶切后，用T4DNA连接酶连接将回收片段连接于XbaⅠ和SalⅠ双酶切处理的plin 8Pr55载体，用连接产物转化DH5α感受态细菌，快提转化子的质粒DNA，经酶切鉴定挑选重组子。

1.4测序策略将gag基因重新克隆到T-easy Vector上，以质粒为模板，采用SP6、T7测序引物测其两端，并在gag基因内部设计不同的引物测序(sk40，在HBX₂定位1673～1652，5′-CCTTGTCTTATGTCCA-3′；gag-g；在HBX₂定位152-2167 5′-CTGGTGGGGCTGTTGG-3′)

1.5基因序列的测定采用Plus Minipreps DNA Purification Systems提取质粒DNA作为测序模板，以不同的引物(见1.4)，采用掺入荧光标记PCR测序试剂盒进行测序反应，用ABI377测序仪测定序列。

1.6基因序列的分析用DNA、DNASIS及GCG软件进行序列的编辑、校对、全基因序列的连接、对应氨基酸的翻译和序列间的比较，国际参考序列下载于美国Los Alamos HIV序列数据库。

1.7gag系列杆状病毒表达质粒的构建将gag、基因片段用EcoRⅠ和SalⅠ从克隆载体上酶切下，回收纯后分别克隆到杆状病毒表达质粒pFastBacl的EcoRⅠ/SalⅠ位点，从而得到相应的中国株gag系列杆状病毒表达质粒。

1.8重组杆状病毒的构建及PCR鉴定按Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的操作程序进行。

1.9重组的Bacmid转染昆虫细胞按照GIBCO公司Bac-to-Bac系统说明进行。

1.10重组HIV-1蛋白的表达和检测用重组的杆状病毒感染对数生长期的Sf9细胞，72 h后分别收集上清和细胞，取部分上清加2×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃5 min，进行SDS-PAGE电泳。细胞悬浮于10倍的预冷的裂解液TNE-Triton (10 mmol/L Tris-Cl, pH8.0; 1 mmol/L EDTA; 150 mmol/L NaCl; 0.2% Triton-X100)，低温裂解30 min，离心取上清用作SDS-PAGE电泳分析。将上述SDS-PAGE凝胶分离的蛋白电转移到硝基纤维素膜上，用HIV-1阳性血清、HRP标记的羊抗入IgG作Western blot分析。

1.11重组HIV-1病毒样颗粒的形态学观察用重组的杆状病毒感染Sf9细胞，48 h后离心收集细胞，用4%的戊二醛-PBS溶液4℃固定后，经组织学处理制作电镜超薄切片，进行电镜观察。

2结果

2.1中国HIV-1毒株gag基因的PCR扩增及克隆gag基因重组质粒的构建见图1。克隆质粒的限制性内切酶分析见图2。

图1gag基因克隆质粒的构建

Fig.1Process of constructing plasmid of gag gene clones

图2重组质粒的限制性内切酶分析

Fig.2Restriction end