关键词: 乳头状瘤病毒；人；基因表达；癌；蛋白质

【摘要】目的研究人乳头状瘤病毒(HPV)主要结构蛋白L1(HPV16 L1)和次要结构蛋白L2(HPV16 L2)在原核系统的表达。方法采用pET-30a载体分别构建pET-30a-L1和pET-30a-L2质粒，并分别转入大肠埃希菌BL21菌株，经IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导，表达融合蛋白6×His-L1和6×His-L2，用SDS-PAGE和Western blot方法进行检测。结果6×His-L1和6×His-L2融合蛋白在BL21菌中高效表达，约2～3 mg/ml，其相对分子质量分别约为60 000和97 000；6×His-L1降解较6×His-L2多。结论HPV16结构蛋白L1和L2能在原核表达系统高效表达；6×His-L2稳定性高于6×His-L1融合蛋白。

Efficient expression of human papillomavirus type 16(HPV16)capsid proteins L1and L2in E.coli

WANG Wenying^*, ZHOU Lanping, SUN Yazhou. ^* Beijing Friendship Hospital, ^* Beijing 100050

【Abstract】ObjectiveTo study the expression of HPV16 capsid proteins L1 and L2 in E.coli.Methods The plasmids pET-30a-L1 and pET-30a-L2 were constructed from the pET-30a vector, and transducted into the BL21. The fusion proteins 6×His-L1 and 6×His-L2 were expressed when induced by adding of IPTG. SDS-PAGE and Western blot analyses were used to detect the expressed proteins.Results Fusion proteins 6×His-L1 and 6×His-L2 were expressed efficiently in E. coli, the Mr were about 60 000 and 97 000 respectively, 6×His-L1 degraded more than 6×His-L2 .Conclusion L1 and L2 proteins were expressed at a high level in prokaryotic expression system, and L2 protein were more stable than L1 protein.

【Key words】Papillomavirus,humanGene protein expressionCancer

人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)基因组由三个部分组成：长控制区(LCR)又称上游调节区(URR)，或非编码区(NCR)；早期区，包括E1、E2、E3、E4、E5、E6和E7；晚期区，包括L1和L2；L1核苷酸序列约1.5 kb， 编码主要结构蛋白L1，相对分子质量约为58 000，L2核苷酸序列约1.5 kb，编码次要结构蛋白L2，相对分子质量约为55 000^［1］。HPVL2和L2基因结构简单，变异性很小，即使发生变异，也不影响蛋白抗原的免疫原性^［2］。HPV型别的确定，是根据新克隆HPV的E6、E7或L1的开放读码框架(ORFs)的核苷酸序列与已知型别的相应序列相比，同源性小于90%以上者为新型，同源性大于90%者为亚型^［3］。目前已发现70多型HPV，根据各型别损害和致癌性，可分为高危型和低危型HPV。粘膜低危型HPV如HPV6和11等，主要引起皮肤和粘膜的良性肿瘤，如皮肤疣，寻常疣，生殖疣等。高危型如HPV16和18等，主要引起恶性肿瘤如宫颈癌、喉癌、肺癌、口腔癌等。根据分子流行病学研究的结果，HPV16是我国妇女宫颈癌的主要型别^［4］。有关HPV癌基因E6，E7的研究已有很多，如E6主要在人的乳房细胞中有活性，E7主要在人和啮齿类的细胞中有活性等^［5，6］。但由于该病毒不能在体外进行培养，妨碍了病毒自然感染历史和装配的研究。对于主要结构蛋白L1和次要结构蛋白L2的研究，目前国内外许多实验室试图用原核系统或真系统表达L1和L2，据推测，真核系统表达的蛋白经过翻译后修饰，形成病毒样颗粒(VLP)，其活性更接近于相应的天然蛋白。但是无论原核或真核系统表达的蛋白，其高产量一直是关键的问题。我们利用原核表达载体pET-30a获得了L1和L2的高效表达菌株。

1材料和方法

1.1材料来源pET-30a载体和BL21菌株由中国医学科学院基础医学研究所生化室赠送；pUC18-L1, pUC18-L2质粒由中国预防医学科学院病毒所遗传室赠送；1 kb DNA ladder为GIBCO BRL公司产品；限制性内切酶Bg1Ⅱ、BamHⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA连接酶，蛋白中相对分子质量标准品为美国Promega公司产品；KpnⅠ为华美公司产品；DH5α为肿瘤研究所保存；Penta-His Ab为德国Qiagen公司产品；GaM-HRP为美国Jackson公司产品。

1.2质粒构建HPV16 L1和L2 ORF克隆到pET30a载体的方法如下：pUC18-L1和pUC18-L2分别用Bg1Ⅱ酶切后，用DEAE-纤维素法回收纯净化，pET30a载体用BamHⅠ酶切后，用同样的方法回收纯净化，然后在T4连接酶作用下，将L1(nt 5 637-nt 7 151)和L2(nt 4 138-nt 5 668)分别克隆到pET-30a的BamHⅠ位点，克隆的结果经酶切鉴定正插方向。pET30a-L1用EcoRⅠ酶切，pET30a-L2用KpnⅠ酶切鉴定。

1.3L1和L2融合蛋白的表达pET30a-L1和pET30a-L2质粒经过42℃90 s，分别转入感受态的BL21菌中，含该质粒的菌在37℃生长至对数中期，(A600 nm=0.6)，加入IPTG使终浓度为1 mmol/L, 诱导3 h冰浴5 min; 5 000 r/min 4℃离心5 min，弃上清，菌体用1/10体积50 mmol/L Tris(pH8.0), 2 mmol/L EDTA重悬，加入溶菌酶(500 μg/ml)和1% TritonX-100(1%体积)，30℃15 min; 12 000 r/min 4℃离心15 min, 弃上清，沉淀中加入1/50体积50 mmol/L Tris(pH8.0), 2 mmol/LEDTA重悬，进行L1和L2蛋白检测。

1.4SDS-PAGE分析上述L1和L2的蛋白悬液分别取1 μl在醋酸纤维素膜上打点，吹干后，用蒸馏水打湿，在10%的丽春红中染色10 min，用水脱色。与标准浓度牛血清蛋白打点图进行比较，确定蛋白悬液的浓度，然后取20 μg蛋白，与等体积2×SDS加样缓冲液混合，煮沸3 min，上样。其中，分离胶浓度为12.5%，浓缩胶浓度为1.67%。采用稳流，蛋白在浓缩胶中用稳流40 mA，进入分离胶后用稳流60 mA，当溴酚蓝迁移至距胶下缘5 mm时，停止电泳。取下胶，在考马斯亮蓝中染色3 h，脱色。

1.5Western blot分析取10 μg L1或L2蛋白，同上进行SDS-PAGE，停止电泳后，用半干式电转移的方法，将凝胶上的蛋白质转移到醋酸纤维素膜上，吹干膜，在10%的丽春红中染色10 min，用水脱色。再晾干膜，在3%BSA(封闭液)中封闭1 h，用TBS-Tween20-Triton X-100(TTT)洗液洗涤5 min，重复3次，加入Penta-His Ab(1∶1 000于封闭液中稀释)，反应1 h，轻轻摇动，用TTT洗液洗5 min，重复3次，加入GaM-HRP(1∶10 000于封闭液中稀释)，闭光反应1 h，轻轻摇动，用TTT洗液洗涤5 min, 重复4次，加入显色液4-氯-1-萘酚进行显色。

2结果

2.1质粒构建和鉴定质粒的构建见图1，酶切鉴定结果见图2。

图1重组表达质粒pET-30a-L1和pET-30a-L2的构建

Fig.1Construction of recombinant expression

plasmids pET-30a-L1 and pET-30a-L2

2.2SDS-PAGE结果在SDS-PAGE的结果中，与pET-30a表达的蛋白相比较，pET-30a-L1和pET-30a-L2表达的靶蛋白分别位于相对分子质量60 000和约97 000处；6×His-L1融合蛋白的相对分子质量约为60 000，6×His-L2的相对分子质量约为97 000。见图3。

图2重组质粒pET-30a-L1和pET-30a-L2鉴定的琼脂糖凝胶电泳

Fig.2Identification of plasmids pET-30a-L1 and

pET-30a-L2 by restriction endonucleases EcoRⅠ

and Kpn Ⅰ in agarose electrophoresis

M:1kb DNA ladder. A:pET-30a-L2/KpnⅠ. B:pET-30a-L1/EcoRⅠ. C:pET-30a/EcoRⅠ

图3大肠杆菌中表达融合蛋白6×His-L1 and6×His-L2的SDS-PAGE电泳(12.5% SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色)

Fig.3SDS-PAGE analysis of 6×His-L1 and 6×His-L2

fusion proteins expressed in E.coli (12.5% SDS-

PAGE,coomassie brilliant blue stain)

M:Midrange molecular weight protein marker; A:L1 protein expressed from plasmid pET-30a-L1; B:L2 protein expressed from plasmid pET-30a-L2; C:Protein expressed from vector pET-30a as control

2.3Western blot结果如图4所示，6×His-L1和6×His-L2均有不同程度的降解，但6×His-L1的降解较6×His-L2更为严重，60 000下方有若干条降解蛋白带；而6×His-L2的97 000下方只有4条很细的降解蛋白带。

图4Penta-His