关键词: 肝炎，乙型；DNA；荧光免疫测定

【摘要】目的研究慢性乙型肝炎急性发作与血清HBV DNA含量的关系。方法采用荧光标记(AmpliSensor)定量方法，测定一组自发性反复发作的慢性乙型肝炎患者发作前、中和后的血清HBV DNA含量的变化。结果①11例患者中有9例(82%)血清HBV DNA含量的高峰值是在最大肝损害之前出现或与丙氨酸转氨酶(ALT)同时达到高峰。而其余2例的高峰值则出现在恢复期；②测定2例数次发作的慢性乙型肝炎患者的系列血清中HBV DNA，也显示了上述特点。并表现出急性肝损害与正常肝功能交替出现的特征。而另1例肝炎肝硬化多次急性发作中，显示持续高水平的病毒血症。结论血清HBV DNA含量的变化与大部分慢性乙型肝炎的急性发作有着密切的关系，提示乙型肝炎病毒的复制启动和激发了机体的免疫反应，导致了肝细胞的损伤。

Relationship between HBV DNA serum level and acute exacerbation of the disease in chronic hepatitis B patients

ZHOU Xiaohui^*, GAO Zhiliang, YAO Jilu. ^* Department of Infectious Diseases, the Second Affiliated Hospital of Medical College of Shantou University, Shantou 515031

【Abstract】ObjectiveIn this study, we evaluated the relationship between HBV DNA serum level and acute hepatic exacerbation of the disease in chronic hepatitis B patients.Methods A series of serum samples from 14 patients of acute exacerbation of chronic hepatitis B were analyzed for alteratieus in serum HBV DNA and alanine transaminase (ALT) level before, during, and after episode of an acute exacerbation. The serum HBV DNA concentrations were tested by the quantitative polymerase chain reaction (PCR) using the AmpliSensor assay.Results ①Serum HBV DNA average levle in 11 patients significantly increased from 7.148±2.008(logarithm) at 2～8 weeks before maximum injury of liver to 8.416±2.160 (logarithm), the time that ALT reached its peak, and then, following the declining of ALT level, decreaed to 6.093±1.428 (logarithm). In 9 of 11 cases, the HBV DNA peak value occurred before the ALT peak level or at the same time; ②Two patients who experienced several episodes of acute exacerbation showed that the appearance of acute hepatic injury and the relatively normal liver function occurred alternatively. Whereas, one patient with liver cirrhosis showed persistence of high level viremia in three episodes of acute exacerbation in one year.Conclusion ①This investigation revealed a clear correlation between increasing level of serum HBV DNA and actue exacerbation of patinets with chronic hepatitis B. The findings suggest that host′s immune response which causes acute exacerbation of liver injury in patients with chronic hepatitis B is triggered by the change of viremia and HBV replication; ②Patients with severe chronic active hepatitis and persistent hepatitis B virus repliation are at very high risk of rapid progression to cirrhosis.

【Key words】Hepatitis BDNAFluoroimmunoassay

慢性HBV感染者的临床谱可从无症状的携带状况、慢性肝炎到肝硬化、肝癌^［1，2］。慢性肝病是最重要的问题。大部分的慢性乙型肝炎(CHB)患者显示出肝损害的急性发作与正常肝功能交替进行的模式^［1］。慢性乙型肝炎的发作通常是自限性的，并多呈亚临床过程，如果没有进行血清生化检查，常被病人及医务人员疏漏。大多数患者发作后转为静止期，少数患者则不断反复并加重，致使肝脏病变持续进展，结果发展为肝硬化，甚至肝癌，并可出现肝功能衰竭而危及生命^［3］。目前认为，慢性乙型肝炎病变活动的主要原因是HBV复制激发机体的免疫损害，其次可能是病毒的基因变异及重叠感染其它病毒等^［4］。本研究采用荧光标记(AmpliSensor)方法，测定一组反复自发性急性发作的慢性乙型肝炎患者的血清HBV DNA含量，拟探讨HBV DNA含量在慢性乙型肝炎发作病程中的变化与病情发作的关系，为进一步研究慢性乙型肝炎反复发作及加重的病因和机制奠定基础。

1材料和方法

1.1病例选择病例来自1996年1月～1998年4月中山医科大学附属三医院传染科住院和门诊病人，共14例(男性12例，女性2例)。年龄平均31.8(19～49)岁。临床诊断：慢性乙型肝炎13例；肝炎后肝硬化1例。诊断符合1995年5月北京第五次全国传染病寄生虫病学术会议—病毒性肝炎防治方案(试行)^［5］。本组患者携带HBsAg均在一年以上(1～28年)，为自发性急性发作。发作时丙氨酸转氨酶(ALT)均增高2倍以上。发作频度1～3次/年，且伴有不同的自觉症状。患者无大量(酒精量＞50 g/日)饮酒史，治疗前后也无使用抗病毒药物、免疫抑制剂及抗肿瘤药物等病史。病例组均给予一般保肝对症治疗，均未使用联苯双脂等各种降酶药物。除有乙型肝炎病毒标志外，其它类型肝炎病毒感染标志均阴性。

我们收集了11例慢性乙型肝炎患者急性发作前、中和后的血清。还对3例慢性乙型肝炎随访观察1～2年，收集患者多次急性发作前、中和后的系列血清。5例献血员(甲、乙、丙、丁和戊型病毒标志阴性)的血清做为阴性对照。全部血清贮存于-30℃冰箱中备检。

1.2实验室检查

1.2.1常规检测肝功能：丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(T-BILI)、胆脂酸(TBA)和谷氨酰转肽酶(ALP)等。

1.2.2采用ELISA方法检测HBsAg、HBeAg、抗-HBc、抗-HBe、抗-HBs、抗-HBc IgM、抗-HAV IgM、抗-HCV(IgM和IgG)、抗-HEV(IgM和IgG)、HDAg、抗-HDV和抗-HD IgM、抗-HGV、抗-CMV(IgM和IgG)、抗-EBV(IgM和IgG)。

1.2.3采用PCR方法检测HBV DNA、HCV RNA和HGV RNA。

1.2.4全部病例行腹部、肝脏、胆囊、脾脏及胰腺“B”超检查。

1.2.5血清HBV DNA含量测定：

采用美国Biotronics公司建立的AmpliSensor方法进行血清HBV DNA的定量检测^［6，7］。检测灵敏度500拷贝/毫升。

1.2.5.1不对称引物：

引物A：5′-TGC TCG TGT TAC AGG CGG GGT-3′

引物B：5′-GAG GCA TAG CAG CAG GAT GAA GAG-3′

1.2.5.2信号引物：5′-TCG CTG GAA GTG TCT GCG GCG-3′

1.2.5.3操作步骤：

(a).提取HBV DNA(ACUPURE DNA/RNA Extraction Kit, 美国Biotronics公司)。

(b).采用不对称引物进行PCR扩增：预变性90℃ 20 s，然后95℃ 25 s 60℃ 25 s、72℃ 30 s。最后72℃延伸1分钟。共19个循环。

(c).加入信号引物扩增：按上述条件循环。每3个循环用AG9600 AmpliSensor DNA分析仪测定一次信号引物能量转移情况。依据纯化的HBV DNA建立的标准曲线，通过计算机采用ASAP专用软件自动分析，直接读取HBV DNA初始模板数。

1.3统计分析假设检验采用单因素方差分析及Newman-Keuls检验两两比较，检验水准a=0.05。所有统计学分析用SPSS软件完成。

2结果

2.111例慢性乙型肝炎急性发作前、中和后的血清HBV DNA含量11例患者血清HBV DNA平均水平在ALT高峰期前(ALT:69.0U/L±56.9U/L)2周～2月为7.418U/L±2.008(对数值)；至ALT高峰期(ALT：480.1U/L±477.6U/L)为8.416±2.160(对数值)；在3周～5月之后，随着ALT下降(ALT:29.3U/L±13.4U/L)而迅速降至6.093±1.428(对数值)(图1)。9例(82%)患者高峰值是在最大肝损害之前或与ALT同时达到高峰，其中5例血清HBV DNA水平高峰值是在最大肝损害前出现，4例则与ALT同时达到高峰。余2例发病前中无明显变化，反而在恢复期有所上升。血清HBV DNA水平发作中，与发作前比较差异无显著性(P＞0.05);与发作后比较差异有显著性(P＜0.05)

2.22例反复发作的慢性乙型肝炎和1例肝炎后肝硬化患者的系列血清测定HBV DNA含量的变化。示例如下：

例1.胡××，男性，34岁。临床诊断：慢性乙型肝炎(中)。HBsAg(+)13年伴食欲下降、尿黄和肝功能异常4年。图2显示了患者自1996年7月、1997年12月2次急性发作前、中和后的血清HBV DNA和生化全貌。病程中，患者HBeAg持续阴性。

图111例慢性乙型肝炎急性发作前、中和后的血清HBV DNA水平变化

Fig.1Levels of serum HBV DNA before, during and after

acute exa