关键词: 蓝舌病毒；L3基因；克隆；表达；杆状病毒

【摘要】目的通过高效表达，研究蓝舌病毒(BTV) VP3的功能，为后续BTV病毒样颗粒的装配作准备。方法克隆出完整的BTV13 L3基因，将其插入杆状病毒表达载体进行表达。结果获得了含有全长L3基因的克隆，VP3在昆虫细胞中得到了高效表达，表达蛋白占细胞总蛋白的10%～15%，VP3与VP7共表达可装配出BTV核心样颗粒。结论在昆虫细胞中表达BTV VP3蛋白具有生物学活性，可用于BTV病毒样颗粒的装配研究。

Cloning and expression of bluetongue virus VP3 protein in insect cells

WANG Jianwei, JLANG Huiying, WEN Leying, et al.

(Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052)

【Abstract】ObjectiveTo elucidate the biological activities of VP3 protein of bluetongue virus (BTV) expressed in insect cells and to assemble, in future, the BTV core-like particles.MethodsFirst, full length of BTV13 L3 cDNA was constructed from 2 sequenced clones. The silver staining of the splicing region proved that the construction was correct. Then, a recombinant baculovirus expression vector pFB1BL3 was constructed to express the L3 gene in insect cells.ResultsBTV13 VP3 could be highly expressed in Sf-9 cells, the production could occupy up to 10%～15% of the total cell protein. Core-like particles could be observed after co-expression of the VP3 and VP7 in insect cells.ConclusionVP3 of BTV expressed in insect cells possesses biological activity and can be used to assemble BTV core-like particles.

【Key words】Bluetongue virusL3 geneGene cloningExpressionBaculovirus

蓝舌病毒(bluetongue virus, BTV)是一种严重危害畜牧业生产的病原，系呼肠孤病毒科环状病毒属原型病毒。BTVL3基因编码的VP3蛋白是BTV最重要的结构蛋白之一。VP3内部包绕着VP1、VP4、VP6和双链RNA基因组，本身形成光滑表面，供VP7附着，二者一起构成了病毒的核心^［1］，因此，VP3蛋白对于蓝舌病毒的毒粒结构具有十分重要的作用。此外，VP3本身氨基酸序列十分保守，含有组特异性抗原成分^［2］，还可能与BTV的毒力有关^［3］。因此，对VP3蛋白实现高效表达，进而研究其结构与功能的关系，以及以此为基础研制新一代的病毒样颗粒疫苗，均具有重要意义。

目前原核表达系统对VP3的表达结果不理想。由于杆状病毒具有外源基因插入容量大、蛋白表达量高、所表达蛋白在抗原性、免疫原性和功能上与天然蛋白接近等优点^［4］，本研究应用该系统对BTV VP3蛋白进行表达。

1材料和方法

1.1质粒和细菌质粒与细菌pUC18BL3.1和pUC18BL3.2为BTV13的测序克隆，由美国犹他州立大学Joseph KK Li教授惠赠^［5］。pCDNA3、pBlueScript SK载体均为本室保存。Bac-to-Bac表达系统购自美国LTI公司。

1.2工具酶与其他试剂T4 DNA连接酶、可扩增长片段的Taq酶(Expand^TM long template PCR system)购自宝灵曼公司，各种限制性内切酶及其工具酶均购自Promega、Biolabs等公司。DNA银染测序试剂盒购自Promega公司。抗BTV1 VP3兔抗血清由作者自行制备^［6］。

1.3引物可扩增BTV L3全基因的PCR引物，由上海生工生物工程公司合成、纯化，其序列为1254#: 5′GCCTGATCAGTTAAATTTCCGTAG3′；1255#: 5′GCCTGATCAGTAAGTGTGTTTCC3′。

1.4DNA银染测序按试剂盒说明书进行。用碱裂解法大提质粒，PEG沉淀纯化作为测序模板。

1.5重组杆状病毒的获得按Bac-to-Bac说明书进行。

1.6重组杆状病毒中L3基因整合的PCR检测杆状病毒基因组DNA模板提取方法参见文献［7］。反应体系各组分参见宝灵曼公司Expand^TM long template PCR system说明书。反应条件为：94℃变性2分钟，然后94℃变性10秒，65℃退火30秒，68℃延伸3分钟，共进行36个循环，最后再68℃延伸7分种，取5 μl PCR产物电泳观察结果。

1.7VP3蛋白在昆虫细胞中的表达获得的重组病毒，以MOI 5-10感染Sf-9细胞，分别在感染后24、48、72、96小时收获细胞，悬于1/20培养体积的PBS中，取少量加入等体积2×SDS-PAGE加样缓冲液进行电泳，观察特异性表达带，并确定其最佳表达时段。

2结果

2.1完整BTV13 L3基因的克隆pUC18BL3.1和pUC18BL3.2分别含有BTV13 5′端1 310和3′端1 570核苷酸，前者的3′末端和后者的5′末端有部分重叠，可通过1 272位的AvaⅡ酶切位点连接到一起。

我们先将这两个片段分别用HindⅢ切下，回收后分别用AvaⅡ消化，回收大片段，共同与已经用HindⅢ线性化的pCDNA3载体连接，将连接子转化DH5 α菌，快提质粒，用HindⅢ酶切，挑选出现2.8 kb的克隆，再进行多种酶切鉴定，得到2个阳性克隆，将其命名为pCDBL3(图1)。对pCDBL3的拼接区域进行了亚克隆测序。银染测序结果表明，L3基因的拼接完全正确。

图1完整BTV13 L3基因的克隆

Fig.1Cloning of full length L3 cDNA of BTV13

2.2BL3杆状病毒表达载体的构建与重组杆状病毒的获得

2.2.1用杆状病毒表达系统对BL3基因进行表达从pCDBL3质粒上切下L3基因，插入杆状病毒表达载体pFastBacl, 得到pFB1BL3(图2)。用pFB1BL3转化DH10Bac宿主菌，经选择性培养，挑取6个白斑，接种选 择性LB扩大培养提取Bacmid, 转染Sf-9细胞，27℃培养72小时，收获培养上清，取微量直接用磷钨酸负染，电镜观察可见杆状病毒出现，证明转染成功。

图2杆状病毒表达载体pFB1B L3结构图

Fig.2Structure of baculovirus expression vector pFB1B L3

2.2.2取少量所得培养上清接种Sf-9细胞扩增病毒取少量上清用PEG沉淀后，提取杆状病毒基因组DNA，PCR扩增可见在大约2.8 kb处出现特异性扩增带，与阳性对照一致，阴性对照(野生型AcNPV)无任何扩增带出现，说明L3基因已整合入杆状病毒基因组中(图3)。将所获杆状病毒命名为rvBacBTVP3。

图3用PCR检测重组杆状病毒中整合的BTV13 L3基因

1～2：重组病毒rvBacBTVP3;3:阳性对照(pCDL3);4:阴性对照(野生型杆状病毒);M:λDNA/HindⅢ分子量标准

Fig.3PCR detection for BTV13 L3 gene integrated into recombinant baculovirus genome

1～2:rvBacBTVP3. 3:Positive control(pCDL3). 4:Negative control(Wild type AcNPV). M:λDNA/HindⅢ marker(23130,9416,6557,4361,2322,2027,564 bp)

2.3VP3蛋白在昆虫细胞中获高效表达并具有生物学活性

2.3.1将rvBacBTVP3感染Sf-9细胞，72小时后将细胞刮下，用PBS洗涤后，悬于1/20培养体积的PBS，取少量进行SDS-PAGE和Western-blot检测，可见在大约100 kD处出现一条清晰的表达带，而正常Sf-9细胞和野生型AcNPV感染Sf-9细胞中均无此带出现(图4)。

图4BTV13 VP3在Sf-9细胞中的表达

1:蛋白质分子量标准(97，66，43，31kD);2:rvBacBTVP3;3:野生型杆状病毒;4:正常Sf-9细胞

Fig.4BTV13 VP3 expressed in Sf-9 cells

A:SDS-PAGE B:Western blot

1:Protein marker (97,66,43,31kD) 2:rvBacBTVP3 3:Wild type AcNPV 4:Mock

2.3.2以MOI 5～10的病毒接种量感染Sf-9细胞，分别在感染后24、48、72、96小时收获细胞进行SDS-PAGE分析，从表达带的变化直接可以看出，VP3在细胞中的积累富集至96小时达到最高峰，证明VP3在细胞中可以稳<