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【摘要】目的研究广东地区鼻咽癌(NPC)细胞株SUNE1中EB病毒LMP1基因的结构特征。方法利用聚合酶链反应从SUNE1细胞基因组中扩增LMP1全长DNA，并克隆到pcDNA3载体中，采用Sanger双脱氧末端终止法测定SUNE1-LMP1 3个外显子及2个内含子覆盖的序列，并与病毒原型B95-8-LMP1进行比较分析。结果克隆到pcDNA3中的SUNE1-LMP1全基因长度为2.6 kb，测序长度为1 312 bp，与B95-8-LMP1比较，核苷酸与氨基酸的同源性分别为98.5%和96%，核苷酸及氨基酸变异主要在第3外显子，但无C端343～352密码子30个碱基的缺失，第1外显子上有XhoⅠ酶切位点的丢失。结论广东地区NPC细胞株SUNE1中，病毒LMP1基因与原型株之间尽管致瘤性存在差异，但仍具有较高的同源性。提示NPC细胞中LMP1的致瘤特征可能并非由于LMP1基因某些特定核苷酸突变所致。
DNA cloning and partial sequence analysis of EBV LMP1 gene isolated from human nasopharyngeal carcinoma cell line SUNE1
CHEN Yuan*, GUO Huiyu, CAO Hong, et al.
(Department of Microbiology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510089)
【Abstract】ObjectiveTo study the variation of EBV LMP1 encoding gene isolated from human nasopharyngeal carcinoma cell line SUNE1 in Guangdong.MethodsThe EBV LMP1 gene was amplified from the SUNE1 cell genome by PCR and then the recombinant vector was constructed by inserting the PCR fragment into pcDNA3. The encoding EBV LMP1 spanning from exon1 to exon3 in recombinant vector was sequenced by the Sequence Analyzer.ResultsThe 1 312 bp encoding EBV LMP1 pieces in 2.6 kb PCR fragments were compared with the same EBV segments in B95-8 cell line. The data indicated that the rate of nucleotide sequence homology between the two fragments is 98.5% and the rate of amino acid is 96%. The restricted enzyme site of XhoⅠ in exon1 was deleted in SUNE1 but the 30bp deletion at the carboxyl terminus in most Chinese NPC LMP1 gene was not present.ConclusionAlthough the LMP1 gene derived from SUNE1 had greater tumorigenicity than that derived from B95-8 cell, the high homology rate of nucleotide and amino acid sequences between them indicated that it was not the result from the variation of certain nucleotide sites but the change in amino acid domain.
【Key words】Epstein-Barr virusNasopharyngeal carcinomaLatent membrane protein 1 geneDNA sequencing
EB病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)与鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)的关系一直是人们研究的一个热点问题。EBV在人群中普遍易感，且可终生携带，但NPC的发生却有明显的地区性［1］。对于NPC细胞中EBV的基因及病毒的存在状况，是长期以来未能解决的问题。LMP1基因由于它在EBV转化B淋巴细胞中起关键作用，而受到人们的普遍关注。目前，已有报道指出，EBV LMP1基因转染细胞接种裸鼠后可以形成肿瘤［2］，同时LMP1基因在不同地域来源的NPC组织及不同分化程度的NPC之间，在序列上存在一定的差异。而来源于NPC组织的EBV LMP1的致瘤能力也明显高于EBV原型细胞株B95-8中的LMP1［3］。因此，研究不同地区来源的NPC细胞中EBV LMP1核酸与蛋白的差异，对于更全面地了解EBV与NPC之间的关系具有重要的意义。
我国广东是NPC的世界最高发地区，为此我们选用了一株从广东地区NPC活检组织细胞中建立的NPC传代上皮细胞株SUNE1，对其进行EBV LMP1序列的测定，推导了其氨基酸序列，并与B95-8细胞中EBV LMP1基因进行了比较，以了解广东地区NPC病人中EBV LMP1的基因状况和变异特点。
1材料和方法
1.1细胞SUNE1细胞由中山医科大学肿瘤研究所惠赠，本室保存。建株过程，按参考文献［4］进行。
1.2质粒和菌株克隆质粒载体pcDNA3由广州暨南大学移植免疫研究所惠赠。DH5α菌株为本室保存。
1.3主要试剂各种限制性内切酶、T4连接酶、Taq DNA聚合酶、低熔点琼脂糖凝胶分别购于上海Promega公司、德国Boechringer Mannheim公司。
1.4引物设计及用途根据文献［5］，参考EBV原型B95-8 EBV LMP1基因序列，设计PCR及测序引物，并在两条PCR引物中分别加入KpnⅠ(上游引物)及XbaⅠ(下游引物)酶切位点。所有引物均由上海生工生物工程公司合成。各引物位置、序列、用途如下：
PCR扩增引物：P1，5′GGTACCTACATAAGCCTCTCACACTG3′(上游引物，169 548 nt-169 527 nt)；P2，5′TCTAGAGAAGGTAAGAGTGCCATC3′(下游引物，166 913 nt-166 930 nt)。
测序引物：P1，5′GGTACCTACATAAGCCTCTCACACTG3′(169 548 nt～169 527 nt); P3, 5′ACTTATTGGAGATGCTCTGG3′(168 928 nt～168 947 nt); P4, 5′TATCTCCAACGAGGGCATAA3′(168 651 nt～168 670 nt); P5, 5′CAGTAAATGGAGGGAGAG3′(168 094 nt～168 111 nt); P6，5′TTATGCCCTCGTTGGAGATA3′(168 651 nt～168 670 nt); P7, 5′CCAGAGCATCTCCAATAAGT3′(168 928 nt～168 947 nt)。
1.5EBV LMP1全基因PCR扩增、克隆与测序以SUNE1细胞DNA为模板，用ExpandTMHigh Fidelity PCR System Kit扩增EBV LMP1全基因。方法参见说明书。PCR产物酶切后用低熔点琼脂糖回收，定向克隆到pcDNA3载体系统中，转化DH5α，挑取菌落，快速提取质粒，酶切鉴定。重组质粒命名为SLMP1-pcDNA3,并用ABI310自动测序仪进行EBV LMP1部分基因双链定向测序。所测序列覆盖LMP1基因第1外显子到第3外显子范围。
1.6其他技术细胞DNA模板提取、DNA酶切、回收、连接、质粒DNA提取等分子生物学技术见参考文献［6］。
1.7软件以DNA SIS分析核酸和氨基酸序列。
2结果
2.1重组载体SLMP1-pcDNA3的构建及鉴定。
2.1.1重组质粒的构建用PCR引物以SUNE1细胞DNA为模板，用PCR方法扩增出EBV LMP1全基因片段。在两端引物分别导入KpnⅠ及XbaⅠ酶切位点，以利于PCR产物定向插入pcDNA3载体质粒中，预计质粒大小为8 002 kb。质粒构建见图1。
图1质粒SLMP1-pcDNA3构建过程
Fig.1Scheme for the construction of plasmid SLMP1-pcDNA3
2.1.2重组质粒的鉴定重组质粒在1%琼脂糖凝胶中电泳，可见所需DNA片段，大小约8.0 kb，与预计值相符。用KpnⅠ、XbaⅠ及BglⅡ酶切鉴定重组质粒插入片段的大小和方向。结果表明目的基因LMP1插入片段在重组质粒中的大小和方向正确(见图2)。
图2重组质粒的酶切图谱
1:分子量标准(λDNA/HindⅢ+EooRⅠ);2:用KpnⅠ和XbaⅠ酶切SLMP1-pcDNA3;3:SLMP1-pcDNA3用BglⅡ酶切
Fig.2Restriction map of recombinant plasmid
1:Molecular marker(λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ. 2:SLMP1-pcDNA3 digested with KpnⅠ and XbaⅠ. 3:SLMP1-pcDNA3 digested with BglⅡ
2.2重组质粒中EBV LMP1部分序列测定结果重组质粒SLMP1-pcDNA3中，EBV LMP1全基因长度为2.6 kb， 其中包括LMP1转录启动子EDL1、LMP1的3个外显子、2个内含子及LMP1蛋白翻译polyA终止信号。对其中3个外显子及2个内含子共1 312 bp进行测序发现，SUNE1 EBV LMP1核酸序列与B95-8细胞EBV LMP1核酸的同源性为98.5%，由序列所推导的氨基酸序列的同源性为96%，其中LMP1基因5′端有XhoⅠ酶切位点的丢失(图3，4)。
图3根据EBV LMP1基因编码区核苷酸序列推导的氨基酸序列
Fig.3Alignments of the deduced amino acid sequence encoding EBV LMP1 of B95-8 and SUNE1
