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【摘要】目的研究特异性细胞免疫反应在病毒性肝炎发生发展中的作用及观察药物等对细胞免疫反应的影响。方法用DNA重组技术构建逆转录病毒重组质粒PLXSN-S，以电穿孔方法转入PA317细胞，筛选高表达克隆，收集其假病毒颗粒感染EL4细胞，经有限稀释选择高表达克隆。结果重组质粒转染PA317细胞后，53个克隆形成(1∶10传代)，在24孔板中扩增后有7个克隆细胞上清HBsAg阳性。用HBsAg A值(曾称OD值)最高克隆的假病毒感染EL4细胞，再经有限稀释得到稳定、高效表达HBsAg的靶细胞系(EL4-S)，在体外传100代以上，HBsAg仍能高效表达(48小时上清中HBsAg的A值达0.85)。经检测PLXSN-S及重组腺病毒rAd-B7-2-S免疫后小鼠对HBsAg特异的细胞免疫反应，得到较为满意的结果。结论我们成功构建了稳定表达HBsAg的靶细胞，对研究HBsAg细胞免疫反应及乙肝免疫发病机理等方面有重要意义。
Production of HBV surface antigen-specific target cell
ZHOU Zhi ZHANG Dingfeng REN Hong
(The Institute for Viral Hepatitis, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400010)
【Abstract】ObjectiveTo analyze the hepatitis B virus surface antigen (HBsAg)-specific cytotoxic T-cell(CTL) response during hepatitis development and investigate the effect of some factors on CTL response.MethodsThe recombinant retrovirus plasmid PLXSN-S was tranferred into PA317 by electroporation and the pseudoviruses produced from PA317 were used to infect EL4. Clones which highly expressed HBsAg were selected with limited dilution.ResultsA clone expressing-HBsAg the highest (A=0.85 in supernatant at 48th hour) was obtained which steadly expressed HBsAg in vitro after at least 100 passages. It worked very well when used as target cells in CTL response after C57 mice immunized with PLXSN-S and recombinant adenovirus vector (rAdv-B7-2-S).ConclusionWe constructed HBsAg-specific target cell line which steadly expressed HBsAg. It may play an important role in HBsAg CTL reponse and immunopathogenetic mechanisms of hepatitis B.
【Key words】Hepatitis BTarget cellCell mediated immunization
乙型肝炎病毒致慢性感染，病情持续活动，可以发展为肝硬化及肝癌。关于乙型肝炎慢性化的机理及乙肝病毒感染后肝细胞大量坏死致重型肝炎的原因尚不清楚。一般认为乙型肝炎病毒感染后并不直接破坏受染肝细胞，肝炎的发生发展被认为是由于受染细胞表达病毒抗原激发相应的免疫反应所致。由于缺乏理想的动物模型及乙肝病毒对宿主的严格限制，给乙型肝炎发病机理研究带来很大的难度。乙型肝炎病毒感染后病毒的清除主要靠CTL和CTL所释放的细胞因子［1］。要研究HBV感染后CTL的数量和质量，以及其它因素(包括药物)对机体细胞免疫反应的影响，则需要构建稳定表达HBV各种抗原的细胞系。由于HBV在体外不能感染细胞，因此只能借助细胞转染技术。因为CTL的作用有MHC限制［2］，所以靶细胞的MHC应与CTL的MHC完全相同才能发生作用。我们构建表达HBsAg的重组逆转录病毒载体，用之转染PA317，然后筛选高表达克隆，用其假病毒颗粒感染C57小鼠淋巴瘤细胞系EL4，经有限稀释获得高表达克隆EL4-S，体外连续传100代以上，HBsAg仍能高效稳定表达，在PLXSN-S及重组腺病毒载体radv-B7-2-S免疫的C57小鼠CTL反应中取得满意结果。现报道如下：
1材料和方法
1.1质粒、菌株及细胞PLXSN为逆转录病毒载体，基本骨架来自PBR322，含SV40启动子，控制G418抗性基因的表达，插入的外源基因表达受逆转录病毒LTR中启动子控制，购于第三军医大学分子生物学教研室；受体菌RR1本所保存，PBKS+-S任红教授提供，PA317、NIH3T3、EL4细胞系购于上海细胞生物研究所。
1.2工具酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4DNA连接酶购于Promega公司，Polybrene Sigma产品，Taq DNA聚合酶、质粒回收试剂盒够于上海华顺公司，中量提取试剂盒Qiagen公司产品。
1.3RNA抽提试剂盒、逆转录PCR试剂盒购于BOEHRINGERMANNHEIM公司，操作按说明书进行。
1.4电穿孔仪Gene PulserR○Ⅱ Electroporation System(BIO-ARD)。
1.5其他试剂DMEM (用于PA317)，1640(用于EL4)购于GIBCO BRL， G418、Polybrene、Mytomycin C购于Sigma公司。乳酸脱氢酶试剂盒够于Promega公司。
1.6电转方法及抗性克隆筛选电转前24 h细胞换培养基，电转时收集细胞并计数。电转缓冲液用无牛血清的DMEM，电转条件：电压200V、电容950UF，电转前后冰浴10 min，电转后48 h以10∶1传代，并加选择培养基(含G418 400 mg/L), 2周后挑取抗性克隆于24孔板中，长满后取上清用ELISA方法检测HBsAg表达，筛选高表达克隆、扩增，收集假病毒颗粒，用于感染EL4细胞，感染后24 h，5∶1传代加筛选培养基(含G418 800 mg/L)，待细胞长满后，用有限稀释法，选择高表达克隆作靶细胞。
1.7抗性细胞克隆表达HBsAg检测上清用ELISA法，细胞膜上HBsAg用免疫组织化学方法(免疫组织化学试剂盒SP kit, Biotech Inc. California USA)购于福建迈新公司，按操作说明书进行。
1.8CTL活性测定a. 制备脾细胞：免疫鼠(免疫方案另文报道)眼球取血后快速取出小鼠脾脏，制备单个脾细胞，并计数，台盼蓝染色检查细胞存活率。每100 ml培养瓶中加10 ml 1640全培养基，含conA 2.5 μg/ml、IL-2 50 u/ml。b. 制备刺激细胞：将EL4-S细胞加入含Mitomycin C 50 mg/L的1640培养基中，37℃，5%CO2孵箱中45 min，用无牛血清的1640洗3次，按刺激细胞：脾细胞=1∶10的比例加入，共培养3 d。c. CTL活性测定：乳酸脱氢酶法，参照试剂盒说明书进行，效∶靶=50∶1、25∶1、12.5∶1、6∶1、3∶1，靶细胞为100 000/ml，每个比例孔重复3次，效靶细胞作用6 h。计算方法：
特异性释放=
2结果
2.1重组逆转录病毒载体的构建、鉴定根据线路图1A，利用限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ从PBKS+-S中切取S片段，定向克隆到真核表达载体PLXSN相应的酶切位点。通过限制性内切酶分析，筛选出阳性克隆，结果如图1B(4) PLXSN-S被切成两段，大片段与空载体相同(1A-3)，小片段与S基因(1A-2)相同，图1C为PCR扩增S基因产物。
图1PLXSN-S构建
1APLXSN-S构建的技术路线图1BPLXSN-S的酶切鉴定(BamHⅠ、EcoRⅠ)图1C重组PLXSN-S PCR分析
Fig.1PLXSN-S construction
Fig.1AScheme of PLXSN-S constructionFig.1BRestriction identification of PLXSN-S with BamHⅠ,EcoRⅠ1:Marker.2:PBKS+-S.3:PLXSN.4:PLXSN-S.Fig.1CPCR analysis of reconbinant PLXSN-S1:Marker.2-4:PLXSN-S
2.2重组逆转录病毒载体转染PA317电转后48 h，按10∶1传代，2周后共得53个克隆，从中挑取10个克隆于24孔板，经ELISA检测有7个克隆表达HBsAg，选高表达克隆，收集假病毒颗粒，滴度为5.7×105CFU/ml。
2.3HBsAg特异性靶细胞系的建立
2.3.1取PA317产生的假病毒颗粒2 ml，加入5×106的EL4细胞中，并加入Polybrene终浓度8 mg/L，每隔30 min摇动1次，共3 h，然后加入1640全培养基，次日5∶1传代，加入选择培养基(含G418 800 mg/L)，细胞长满培养瓶后，取48 h上清反复测定HBsAg，其A值均在0.2以上(cutoff值=0.1)，免疫组化检测HBsAg阳性细胞数(以100个计)，至少在80%以上，如图2。
图2免疫组化检测HBsAg表达×200
Fig.2HBsAg expression detected by immunohisto chemistry×200
2.3.2RT-PCR检测HBsAg基因在EL4细胞中转录(图3示逆转录S片段)。
