关键词: 戊型肝炎病毒；基因表达；疫苗

【摘要】目的获得可用于研制戊型肝炎疫苗的基因工程抗原。方法用非融合蛋白表达载体pET-11 a，表达戊型肝炎病毒(HEV)第二读码框区(ORF2)224-660 aa段蛋白。结果得到分子量为50 000的表达产物，经Western blot证实，表达产物具有HEV特异抗原性。结论该基因工程抗原可能具有制备戊型肝炎疫苗的前景。

Expression of hepatitis E virus structural gene in E. coli.ZHANG Mingcheng, ZHAO Honglan, JIANG Yongzhen, et al. Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052

【Abstract】ObjectiveTo obtain recombinant antigen for development of vaccine against hepatitis E virus.MethodsAmplified the structural gene (5 816-7 126 nt) by PCR. The upstream primer was 5′-CCATATGAATTCAATAACCTC-3′ and the downstream primer was 5′-GGGATCCTATAACTCCCGAGT-3′. Cut the PCR product with Nde I and BamHI, then inserted this fragment into the plasmid pET-11 where a cut was by the same restriction endonucleases. The expression plasmid named pEa47 was transformed into E. Coli BL21. The recombinant strains were grown at 37℃ and induced by IPTG. The recombinant protein was confirmed by Western blot analysis using serum from hepatitis E patient.ResultsThe structural gene of hepatitis E virus from open reading frame 2,224-660 aa, was expressed in E. Coli BL21. Western blot assay showed that the expressed 50 000 recombinant protein specifically reacted with the serum antibody from the hepatitis E patient.ConclusionThe protein might be useful to develop vaccine against hepatitis E virus infection.

【Key words】Hepatitis E VirusGene ExpressionVaccine

戊型肝炎病毒(简称HEV)经消化道传播，有两种流行模式：一种是由粪便污染水源引起的大规模暴发流行，主要发生在不发达国家和地区；另一种是由于个人及公共卫生不良，导致的散发流行，在全世界范围内广泛存在。HEV感染所致肝炎发病率高，孕妇感染的死亡率，高达10%～20%，严重危害人类健康。

对本病的预防，除了采取防止水源污染、改善卫生状况等切断传播途径的措施外，疫苗的应用是根本手段。资料表明，HEV在世界范围内，虽然存在不同毒株间的基因差异，但只有一个血清型^［1］。交叉攻击试验也显示，感染一种毒株的动物，可获得对另一毒株的免疫力^［2］。

动物实验证实，采用HEV ORF2基因表达的重组抗原免疫动物，可以成功地保护其免受HEV的感染和发病^［3，4］。对亚洲HEV结构蛋白的变异分析提示^［5］，使用中国HEV结构区基因发展戊型肝炎疫苗，可对亚洲地区戊型肝炎流行的控制和预防发挥作用。为此目的，我们表达了包含HEV主要抗原表位^［6～8］的ORF2 224-660 aa(5 816～7 128 nt)区段。

1材料和方法

1.1菌粒和质粒HEV基因为本实验室与美国疾病控制中心合作完成克隆^［9］。大肠杆菌BL21为Novagen公司产品，载体质粒pET-11 a为Invitrogen公司产品。

1.2酶与试剂限制性内切酶Nde I, BamH I, 为New England Biolabs公司产品，Taq DNA Polymerase, T4 DNA Ligase为Progmega公司产品。

1.3引物设计与合成引物合成参照HEV中国新疆株序列。上游引物(EF)为5′-CCATATGAA

TTCAATAACCTC-3′，引入Nde I位点；下游引物(ER)

为5′-GGGATCCTATAACTCCCGAGT-3′，

引入BamH I位点。引物由中国科学院微生物研究所合成。

1.4表达克隆的构建用PCR方法扩增目的基因，用Nde I和BamH I双酶切后，将1.3 kb条带回收，插入用同酶处理的表达载体质粒pET-11 a中。连接产物转化菌株BL21，提取质粒，酶切鉴定。

1.5重组抗原的表达及鉴定将表达质粒转化BL21菌株，挑单斑接种于含100 mg/L氨苄青霉素的LB(AP⁺LB)培养基中，37℃振荡培养至对数生长期，加IPTG至终浓度为100 mmol/L，诱导表达4 h，离心收集菌体，用lxloading buffer重悬。将此样品用SDS-PAGE及Western blot方法进行分析。

2结果

2.1表达质粒的构建按设计方案，将HEV ORF2 224-660 aa段cDNA成功地插入表达载体质粒pET-11 a中，经酶切鉴定，正确的重组质粒命名为pEa47(图1)。

图1表达质粒pEa47的构建

Fig.1Construction of the expression plasmid pEa47

2.2重组抗原的SDS-PAGE及Western blot分析SDS-PAGE显示(图2)，转化pEa47的菌株，表达出50 000的重组蛋白条带，与预期分子量相符，表达产量约占菌体总蛋白的40%。用戊型肝炎病人阳性血清做蛋白印迹试验，重组蛋白与戊型肝炎病人的血清产生特异反应(图3)，说明重组蛋白具有戊型肝炎病毒特异抗原性。

图2重组蛋白的SDS-PAGE(10%)分析

1：蛋白质分子量标准；2：pET-11 a转化的BL21菌株；3：pEa47转化的BL21菌株

Fig.210%SDS-PAGE analysis of the

recombinant protein

lane 1: Protein molecular weight marker. Lane 2: BL21 transformed with pET-11 a. Lane 3: BL21 transformed with pEa47

图3重组蛋白的Western blot分析

(图示同图2)

Fig.3Western blot analysis of the

recombinant protein

(Illustrations were the same as in Fig.2)

3讨论

我国新疆地区，曾发生多达数十万病例的戊型肝炎暴发流行，其他地区也发生过较小规模的暴发流行，散发流行更是遍及全国。研制戊肝疫苗对本病的预防意义重大。

戊型肝炎病毒结构蛋白主要由ORF2基因编码。以往的实验证明，ORF2 C端2/3区域，包含了HEV主要的抗原表位，其中包含中和抗原决定簇^［3，4］。

我们表达的HEV ORF2 224-660 aa段蛋白，包含了这些抗原表位，表达产物经ELISA(资料待发表)及Western blot证明，具有HEV特异性抗原性。国外学者用该段基因做了融合表达，并用表达产物(trpE-HEV)进行了灵长类动物免疫原性研究，结果证明其具有免疫原性，免疫动物获得对HEV的保护性。

我们表达的产物为HEV天然蛋白，不含非戊肝前导肽，可能优于融合蛋白。该抗原可能具有制备戊型肝炎疫苗的前景。

参考文献

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