关键词: 非复制型痘苗病毒载体；狂犬疫苗；减毒；瞬时显性选择；免疫原性；安全性

【摘要】目的提高表达狂犬病毒糖蛋白(RG)的重组痘苗病毒的安全性。方法将编码中国狂犬病毒5 aG株糖蛋白的基因，插入痘苗病毒天坛株的TK区，获得重组病毒VTKRG，通过两步同源重组，删除CK片段间与痘苗病毒毒力及宿主范围相关的基因，得到非复制型重组痘苗病毒VTKRG△CK。结果经PCR鉴定，CK间的核酸片段被成功删除，其缺失性状能稳定地遗传。Western Blot及间接免疫荧光结果表明，VTKRG△CK能有效地表达RG。该病毒在鸡胚成纤维细胞中繁殖，在人源细胞如TK143中几乎不增殖。动物实验证实，VTKRG△CK免疫小鼠后能诱生中和抗体并能保护小鼠抵抗致死剂量狂犬病毒(RV)的攻击。结论VTKRG△CK具有良好的免疫原性和更高的安全性。

Construction and characterization of non-replicating recombinant vaccinia virus expressing rabies glycoprotein.LI Ping, HU Qiaoling, SUN Zhaohui, et al. Wuhan Institute of Biological Products, The Ministry of Health, Wuhan 430060

【Abstract】ObjectiveTo improve the safety of recombinant vaccinia rabies virus, the non-replicating recombinant vaccinia rabies virus VTKRG△CK was constructed.MethodsThe rabies glycoprotein(RG) gene was introduced into the TK locus of Chinese Tiantan strain of vaccinia virus(VTKRG), and a fragment between fragment C and fragment K involving vaccinia virus virulence and host-range related genes were deleted by homologous recombinant.ResultsThe ability to replicate in primary chick embryo fibroblast(CEF) and dramatically reduced replicating capability in mammalian cells of the virus were observed, whereas VTKRG△CK could express high level of RG efficiently. The expression of RG could be detected in CEF by indirect immunofluorescence assay and Western blot analysis. The VTKRG△CK could elicit neutralizing antibody against CVS rabies virus and protect the animals from lethal rabies virus challenge in inoculated mice.ConclusionVTKRG△CK possesses immunogenicity and higher safety.

【Key words】Non-replicating vaccinia virus vectorRabies vaccineAttenuateTransient dominant selectionImmunogenicitySafety

狂犬病是一种严重威胁人类健康，但尚无法治疗的恶性传染病，唯有疫苗能有效地控制该病的发生。由于当前使用的组织培养狂犬疫苗存在生产成本高、副反应大、热稳定性差等诸多缺点，因此，迫切需要研制高效、安全、价廉的基因工程疫苗，以满足市场的需求。国外和本室相继报道，表达狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein, RG)的重组痘苗病毒，具有良好的免疫效果^［1，2］。虽然痘苗病毒作为基因工程疫苗载体具有许多优越性，然而，其罕见严重的并发症限制了它更广泛地应用。近年来，随着MVA、NYVAC、ALVAC等非复制型痘病毒载体的问世，痘病毒的安全问题已基本得以解决^［3］。1994年，中国预防医学科学院病毒学研究所阮力实验室成功地构建了一系列质粒，能定点删除痘苗病毒天坛株中与毒力相关的核酸片段，极大地降低了痘苗病毒的毒力^［4］。本研究按人用疫苗标准设计，利用这些质粒进行删除工作。首先，选择能诱生中和抗体的RG基因作为靶基因，将其插入痘苗病毒天坛株的TK区，然后删除痘苗病毒基因组CK片段间与痘苗病毒毒力及宿主范围相关的基因，获得了非复制型重组痘苗病毒VTKRG△CK。现对其减毒特性和免疫原性进行报道。

1材料和方法

1.1质粒与菌株质粒pJSB1 175, pNeoCKLacZ, pNeoCK由中国预防医学科学院病毒学研究所遗传室提供^［4］。pNeoCKLacZ和pNeoCK用于删除痘苗病毒基因组C、K片段间与毒力和宿主范围相关基因。pBluescript-RG, E. coli DH5α由本室保存。

1.2病毒和细胞痘苗病毒V1 175，为TK区插入LacZ基因的重组病毒，由本室提供^［5］；人TK143细胞由中国预防医学科学院病毒所遗传室提供；原代鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast, CEF)用9日龄鸡胚，按常规方法制备。

1.3酶与试剂限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、lipofectin转染试剂盒均购Gibco. BRL公司；Taq酶购自华美生物工程公司；地高辛DNA标记及检测试剂盒购自Borhinger Mannhim公司；G418购自Sigma公司；抗RG单克隆抗体由美国CDC Dr. Smith惠赠；荧光标记羊抗鼠IgG抗体及辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体由本所免疫室提供。引物1和引物2由病毒所遗传室提供，分别为痘苗病毒天坛株C片段和K片段的两段核苷酸序列，因该缺失载体正在申请专利，具体序列暂不便公开。其他化学试剂均为国产AR级。

1.4重组质粒pJSB1 175RG的构建参照文献［6］。

1.5重组痘苗病毒VTKRG的构建、筛选 及纯化利用pJSB1 175RG与痘苗病毒V1 175在CEF中进行同源重组，将RG基因送至痘苗病毒的TK区，具体方法见文献［5］。

1.6重组病毒VTKRG中RG基因的检测常规方法提取痘苗病毒DNA^［7］，与地高辛标记的RG cDNA探针杂交，具体操作见试剂盒说明书。

1.7非复制型重组痘苗病毒VTKRG△CK的构建、筛选及鉴定以0.01pfu/cell的VTKRG感染90%成片的CEF，37℃吸附1小时后，利用lipofectin将质粒pNeoCKLacZ导入细胞，37℃培养60～72小时后，收获病毒，冻融3次作为重组液。将重组液在含G418 400 μg/ml的CEF中连续传3代；然后在无G418的CEF中传2～3代。将如此处理的重组液感染CEF，37℃培养72小时后铺入含有X-gal和中性红的营养琼脂，随机挑选若干个孤立的蓝病毒斑于含2%小牛血清的维持液中冻融3次。根据它们在CEF和TK143细胞中生长特性进行筛选^［8］。将筛选出的VTKRG△CKLacZ与质粒pNeoCK在CEF中进行同源重组，构建VTKRG△CK，方法同前，将挑取的白病毒斑扩增后提取其DNA，以PCR方法进行鉴定。循环参数为：95℃预变性5分钟，95℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟，共30个循环，72℃10分钟。

1.8VTKRG△CK在CEF和TK143细胞中生长特性比较以相同的病毒量同时感染CEF和TK143细胞，37℃培养72小时，染色计数。

1.9VTKRG△CK表达产物的检测间接免疫荧光法和Western blot按常规方法进行^［7］。

1.10小鼠中和抗体测定和攻击试验于0，7天以0.3 ml(2×10⁸pfu/ml)的VTKRG△CK皮下免疫小鼠2次。于14天、21天、28天采血，以小鼠中和实验(mouse neutralizing test, MNT)测定其中和抗体^［9］，第21天以10LD₅₀CVS株狂犬病毒肌肉攻击小鼠，观察保护效果。同时，以VTKRG及痘苗病毒天坛株免疫小鼠作为对照。

2结果

2.1非复制型重组病毒VTKRG△CK的构建与鉴定

2.1.1复制型重组病毒VTKRG的构建与鉴定RG是狂犬病毒5种结构蛋白中唯一能诱生中和抗体的组分，RG基因开放阅读框架全长1 575 bp，编码505个氨基酸的成熟糖蛋白及N-端19个氨基酸的信号肽。将pBluescriptRG中的RV5aG株的RG基因克隆至pJSB1 175质粒中，使RG的表达受P7.5启动子的控制(图1)。构建成重组质粒pJSB1 175RG, 以V1 175为亲本毒种，pJSB1 175RG作为转染质粒，通过二者在CEF中发生同源重组，RG取代TK区的LacZ基因，即从蓝斑中挑选白斑筛选重组病毒。重组病毒经纯化、扩增后，提取VTKRG DNA，以天坛株DNA作为阴性对照，以质粒pJSB1 175RG为阳性对照，打点至硝酸纤维膜上。以地高辛标记的RG基因作为探针进行杂交。结果显示，重组病毒中有RG基因的存在(图2)。

图1pJSB1 175RG的结构

Fig.1Map of pJSB1 175RG expressing rabies glycoprotein

图2斑点杂交检测VTKRG中的RG基因

Fig.2Detection of RG gene in VIKRG by dot blotting

1: pJSB1 175RG. 2: VTKRG. 3: Vaccinia virus Tiantan strain

2.1.2VTKRG△CK的构建与鉴定首先将pNeoCKLacZ与VTKRG共转染CEF，利用G418-Neo(选择压力)和蓝白斑筛选标记，可得到含有全部质粒序列的中间重组体。去除G418(压力)后，其内部同源序列间发生第二次同源重组，即可获得VTKRG△CKLacZ，基因组中的大部分C、K片段已经缺失，被LacZ取代。为了从VTKRG△CKLacZ中删除LacZ基因，达到人用疫苗研制的要求，再将VTKRG△CKLacZ与质粒pNeoCK在CEF中进行同源重组，用质粒中的CK结构取代病毒中的LacZ, 以获得VTKRG△CK。由于重组病毒缺失了CK间大部分基因，采用引物1和引物2，通过PCR方法可以扩增出一小片段(图 3)。而<