关键词: 乙型肝炎病毒；细胞凋亡

【摘要】目的阐明HBV对感染细胞凋亡的影响。方法HepG2及其转染HBV的HepG2.2.15细胞培养中，加MTX、Act D或去血清培养，以FCM检测细胞凋亡率。结果HepG2.2.15细胞加MTX后24小时和48小时，凋亡率分别为10.8%和13.3%，加Act D后分别为16.8%和37.7%，去血清后第4天及第6天，分别为13.2%和14.8%；而HepG2细胞加MTX后24小时和48小时，凋亡率则为12.6%和65.3%，加Act D后分别为44.5%和89.7%，去血清后第4天和第6天凋亡率为19.8%和28.8%。结论在上述条件下，HepG2.2.15细胞较HepG2细胞耐受凋亡；HBV可能抑制肝癌细胞凋亡。

Tolerance of HepG2and HepG2.2.15cell lines to different apoptotic stimuliZHU Youfu, LUO Kangxian. Department of Infectious Diseases of Nanfang Hospital, The First Military Medical University, Guangzhou 510515

【Abstract】ObjectiveTo elucidate the effect of HBV on hepatocyte apoptosis.MethodsThe HepG2 cells and the HBV transfected HepG2.2.15 cells were cultured with MIX or ActD or cultured in DMEM medium without serum, The apoptosis was examined with FCM.ResultsThe apoptotic rates of HepG2.2.15 cells at 24 h and 48 h after MTX addition were 10.8% and 13.3%, at 24 h and 48 h after Act D addition were 16.8% and 37.7%, and at 4 th and 6 th day after serum withdrawal were 13.2% and 14.8%, respectively. While those of HepG2 cells were 12.6% and 65.3%, 44.5% and 89.7%, and 19.8% and 28.8%, correspondingly.ConclusionHepG2.2.15 cell was tolerant to these apoptotic stimuli, and it might be inferred that HBV inhibits hepatocyte apoptosis.

【Key words】Hepatitis B virusApoptosis

一些病毒可引起感染的细胞凋亡，另一些则抑制凋亡，而且同一病毒的不同表达产物，也可有不同的作用。乙型肝炎病毒(HBV)对凋亡的影响如何，尚少报道。HBV感染及其相关慢性肝病中，发现有肝细胞凋亡，与炎症活性相关^［1］。虽然很多慢性无症状HBV携带者肝细胞中，有大量病毒复制，但罕见凋亡发生，提示HBV并不直接诱导肝细胞凋亡。HepG2细胞是分化较好的人肝癌细胞^［2］，产生蛋白的功能与正常肝细胞近似；转染2拷贝HBV后称为HepG2.2.15细胞^［3］。本研究比较了HepG2与HepG2.2.15细胞对氨甲喋呤(Methotrexate, MTX)、放线菌素(Act)D及去血清引起凋亡的耐受性。

1材料和方法

1.1细胞准备HepG2细胞系及其已转染HBV的HepG2.2.15细胞是人肝癌细胞株，引进后在本实验室长期培养。人肝癌细胞系HepG2细胞及其转染HBV的HepG2.2.15细胞，培养于DMEM培养液中(含10%胎牛血清、0.3%谷氨酰胺、青链霉素各100 IU/ml)。

1.2HepG2和HepG2.2.15细胞的比较实验

1.2.1对MTX的耐受6孔板中接种HepG2和HepG2.2.15细胞，洗涤后实验组加MTX10 mg/L, 对照组换入原用的新鲜培养液，37℃，CO₂温箱培育，分别收集24小时和48小时组的细胞(包括上清中飘浮的细胞)，洗涤、70%乙醇固定过夜，溴化丙啶(PI，Sigma产品)染色，荧光显微镜摄片，流式细胞仪(美国Coulter公司产品)以溴化丙啶染色的亚G1峰检测其凋亡率。

1.2.2对ActD的耐受换用ActD50 μmol/L，实验同上。

图1A.MTX诱导HepG2细胞凋亡，可见细胞核浓缩及碎裂.B.对照.PI染色×400

Fig.1A: MTX induced HepG2 apoptosis, showing nuclear fragments and condensation. B: Control. PI staining, Magnification×400.

1.2.3对去血清的耐受接种12小时的HepG2和HepG2.2.15细胞，洗涤后实验组换入无血清的基础培养液，对照组换入原用的新鲜培养液，CO₂温箱培育，6日内每天收集细胞，同样检测其凋亡率。

2结果

2.1对MTX的耐受HepG2细胞培养中加MTX后12小时开始细胞凋亡，镜下可见细胞浮起，胞体皱缩、出芽，或碎袭成凋亡小体(图1)。流式细胞仪检测HepG2细胞24小时和48小时的凋亡率，分别为12.6%和65.3%；而HepG 2. 2. 15细胞为10.8%和13.3%(图2)。

图2HepG2及HepG2.2.15细胞对MTX诱导的凋亡的耐受性

Fig.2Apoptotic sensitivity of HepG2 andHepG2.2.15 cells to MTX

2.2对Act D的耐受加入Act D后HepG2细胞24小时和48小时的凋亡率，分别为44.5%和89.7%；而HepG2.2.15细胞为16.8%和37.7%(图3)。

图3HepG2及HepG2.2.15细胞对Act D诱导的凋亡的耐受性

Fig.3Apoptotic sensitivity of HepG2 and

HepG2.2.15 cells to Act D

2.3对去血清的耐受培养液中去血清3天后，镜下见HepG2细胞生长缓慢直至停滞，细胞稀疏、菲薄，逐渐发生凋亡而收缩、浮起。检测第2、4、6天的凋亡率，分别为10.5%、19.8%和28.8%。而HepG2.2.15细胞则依然缓慢增殖，仅见胞浆内脂滴稍变大，流式细胞仪检测分别为12.2%、13.2%和14.8%(图4)。

图4HepG2及HepG2.2.15细胞对去血清诱导的凋亡的耐受性

Fig.4Apoptotic sensitivity of HepG2 and

HepG2.2.15 cells to serum free DMEM mediam

3讨论

病毒基因组的编码产物，可正向或负向调节凋亡。一般认为，致细胞病变性病毒诱导凋亡；非致细胞病变性病毒则抑制凋亡^［4］。另一方面，RNA病毒多诱导调亡；而DNA病毒大都抑制凋亡^［5］。病毒抑制凋亡可延长感染细胞的生命，有利于病毒复制、扩散和感染持续。

MTX、Act D和去血清对HepG2.2.15和HepG2细胞凋亡的影响，表明HepG2.2.15细胞较HepG2细胞耐受凋亡，提示HBV可能抑制肝癌细胞凋亡。

DNA病毒抑制细胞凋亡的基因产物，已经鉴定的有痘苗病毒的CrmA^［6］、猿猴病毒(SV)40的T抗原^［7］、6型人乳头瘤病毒(HPV6)的E6^［8］等。HBV编码7种病毒蛋白，其中哪一些蛋白通过什么机制发挥作用，尚未充分阐明。新近获知，HBV以其基因表达产物HBx蛋白参与细胞凋亡的调节。HBx与P⁵³有直接联系，P⁵³介导调亡，HBx与P⁵³结合从而阻断P⁵³介导的凋亡^［9］。HBx也激活细胞信号转导途径ras/raf/丝裂原蛋白激酶的级联和NFkB，通过这些机制抑制凋亡，从而诱导肿瘤发生^［10］。

参考文献

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［2］HepG2. In: Product sheet, ATCC HB-8065, American Type Culture Collection.

［3］Sells MA, Chen ML, Acs G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84: 1005-1009.

［4］Marianneau P, Cardona A, Edelman L, et al. Dengue virus replication in human hepatoma cells activates NF-kappa β which in turn induces apoptotic cell death. J Virol, 1997, 71: 3244-3249.

［5］Revlla Y, Cebrian A, Baixeras E, et al. Inhibition of apoptosis by the African swine fever virus Bcl-2 homologue: role of the BH1 domain. Virology, 1997, 228:400-404.

［6］Kibler KV, Shors T, Perkins KB, et al. Double stranded RNA is a trigger for apoptosis in vaccinia virus-infected cells. J Virol, 1997, 71:1992-2003.

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［8］Elbel M, Carl S, Spadena S, et al. A comparative analysis of the interactions of the E6 proteins from cutaneous and genital papilloma-viruses wit