关键词: 肝炎病毒，乙型；基因/遗传学；限制性片段长度多态性

【摘要】目的明确乙型肝炎病毒(HBV)C基因启动子(BCP)与前C变异株在慢性乙型肝炎患者中的动态消长，及与HBeAg血清学状态的关系。方法对32例慢性乙型肝炎患者的105份系列血清进行错配聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性分析，并对其中15例患者系列血清标本的PCR产物进行直接测序。结果BCP和A83变异株感染率均明显增高(62.5%＞46.9%；31.3%＞12.5%)；BPC变异株更多地(14/16)表现为优势积累，且先于HBeAg血清阴转；BCP野株/变异株比例变化影响HBeAg血清学的稳定性。结论两种类型的变异株在炎症活动中均具有选择优势，最终造成HBeAg(-)的HBV感染；可能与HBV感染之持续有关。

Dynamic changes of basal core promoter and pre-core mutants of hepatitis b virus in patients with chronic hepatitis B virus infectionCHEN jinjun, HOU Jinlin, WANG Zhanhui, et al. Deprtment of Infectious Diseases, Nanfang hospital, Guang zhou 510515

【Abstract】ObjectivesTo clarify the association of hepatitis b virus mutants in basal core gene promoter and pre-c region with serum HBeAg state and persistent HBV infection.Methods32 patients, who infected with hepatitis B virus and suffered from several exacerbation during the course of this diseae, were followed up for an average of 20.8 months. Using two mis-matched primers to amplify BCP and pre-c gene fragments, in combination with restricted fragment length polymorphism assay, we studied the presence of these two mutants(nt 1762A→T, 1764G→A and nt1896G→A)in 105 serum samples. Direct sequencing was performed on 15 patients′serial samples to identify the efficiency of these rapid and simple methods and other variations in these regions.ResultsThe presence of these two kinds of mutants increased during the following-up, (62.5%＞46.9%;31.3%＞12.5%). In most cases, two mutants prevailed and finally displaced the wild type virus; the serology of HBeAg was affected predominantly by the ratio of BCP mutant to wild type.ConclusionBCP and pre-c mutants emerged in the course of chronic infection and were selected positively by the inflammation activity. The serological conditions of HBeAg were changed when the predominant situationsof these two mutants were established. The survival of these two mutants implied that mutations in these two regions may contribute to the persistent infection of hepatitis B virus.

【Key words】Hepatitis B virusGene/geneticsRestricted fragment length polymorphism

乙型肝炎病毒(HBV)的变异是较普遍的现象。前C变异，主要是第1 896位核苷酸(nt)G→A的突变，它是HBeAg阴性HBV感染的主要原因^［1，2］。最近的研究表明，C基因启动子(BCP)变异，尤其是nt1762 A→T和nt1 764 G→A的联合突变(T1 762/A 1 764)，由于涉及到BCP区调控前C mRNA转录的第2个AT丰富区，因此可导致前C mRNA的转录效率下降，从而造成无HBeAg血症的HBV感染^［3，4］。我们设计了一条错配引物^［5］，应用PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的方法，对143例HBV慢性感染者T1762和A1 764联合变异的基本情况进行了研究，发现此类型的变异在我国相当普遍^［6］。为进一步明确BCP变异与HBeAg血清学状态及HBV感染持续的关系，我们对其中的32例慢性乙型肝炎患者进行了回顾性研究。

1材料和方法

1.1病人南方医院1990年1月～1996年12月收治的32例慢性乙型肝炎患者，男性28例，女性4例；平均年龄30.6岁(18～56岁)。24例在首次住院时经肝活检证实；8例在研究过程中发展为肝硬化。诊断标准按1995年第五届全国传染病寄生虫病学术会议通过的标准。研究跨度平均为20.8个月(8～51个月)，27例经历了1～4个血清丙氨酸转移酶(ALT)峰值(＞5倍正常值)，其他5例患者的ALT水平为持续轻度异常。在随访期间，所有研究对象均未使用血液、血液制品或抗病毒药物治疗，无一例混合感染丙型肝炎病毒或丁型肝炎病毒。

1.2血清标本以第1次入院时为研究起始，随访到的最后1次血清为末，其中25例不同时间点的血清标本在3份或3份以上。取样间隔2～12个月。

1.3肝炎标志物检测HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗HBc、抗HBc IgM、抗-HCV及抗-HDV均以酶免疫法检测，试剂盒为中山生物工程公司(广东中山)产品，按照说明书进行操作。

1.4HBV DNA抽提^［2］常规酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，溶于20 μl蒸馏水中。

1.5HBV DNA的扩增引物P11(负链引物，nt1 786-1 765，5′-CTACAGCCTCCTAGTACAATG

a-3′)的设计：将第1 767位核苷酸A改为T，如HBV毒株为nt1 762A→T及 nt1 764G→A的联合突变，则可在PCR产物中引入一个Bcl Ⅰ酶切位点(T↓GATCA)。引物Ce(正链引物，nt1873-1 895，5′-CAAGCTGTGCCTTGGGTGGCCTT-3′)的设计参见文献［2］。以6～8份标本为一组设置阴性对照，严格操作防止污染。首先，以P9(正链引物，nt1643-1 664，5′-CAAGGTCTTGCATAAGAGGACT-3′)和C1(负链引物，nt2 394-2 370,5′-GGCGAGGGAGTTCTTCTTCTAGGGG-3′)行第1轮PCR扩增，获得BCP和前C片段；然后分别以P9和P11以及Ce和BC1(负链引物，nt1974-1 955，5′-GGAAAGAAGTCAGAAAGGCAA-3′)和第2轮PCR，得到错配的BCP和前C产物。

1.6RFLP分析参见文献［2，5］，将BCP和前C区的错配PCR产物7 μl分别与BclⅠ5U以及Bsu36Ⅰ5U混合，均设有阳性对照；50℃或37℃水浴2小时，3%琼脂糖凝胶电泳。BclⅠ酶切结果判定：若仅出现144 bp或120 bp带，为单一野毒株或变异株感染(++++)；如果两带同时出现，则为混合感染，根据其荧光强弱判断二者的相对比例，分为：优势株(+++)或弱势株(+)及均势株(++)。Bsu36Ⅰ酶切结果判定参见文献［2］。

1.7PCR产物直接序列分析以BC1或P9为测序引物，对BCP及前C(nt1 742-1 901)进行序列分析，参见文献［5］。

2结果

2.1HBV C基因启动子及前C变异株的感染率及优势变化情况研究起始时，BCP变异株感染率为46.9%(15/32)，结束时为62.5%(20/32)，后者明显高于前者，经统计学处理，U=2.29，P＜0.01；A83的感染率分别为12.5(4/32)%和31.3%(10/32)，随访结束时的感染率增高，经统计学处理，U=1.87，P＜0.05。在随访过程中，16例患者HBV bCP变异株与野株比例发生了变化，其中表现为优势积累者14例(87.5%)，优势弱化者2例(12.5%)，前者远高于后者(U=4.24，P＜0.001)。可以观察到BCP变异株/野株相对比例的变化与HBeAg的血清学状态有关。见图1。

图12例慢性肝炎患者系列血清标本BCP片段的PCR-RFLP结果

病历A的三个时间点为93-06-05，94-09-08(HBeAg阳性)及96-06-26(HBeAg阴性)；

病历B的时间点分别为92-11-03，94-06-29和96-10-10，HBeAg持续阳性

Fig 1PCR-RFLP results of HBV BCP fragments from two patients′ serial serum samples suffered from chronic hepatitis

Three points of as A were 05-06-93, 08-09-94 and 26-06-96 respectively, and the serum HBeAg status was positive, positive and negative accordingly. Three points of as B were 03-11-92, 29-06-94 and 10-10-96,the HBeAg status was

persistently positive.

2.2各组患者中HBV C基因启动子及前C变异的动态变化①HBeAg持续阳性者6例；开始时，2例为BCP变异株(弱势株)感染，在随访结束时，2例BCP变异株均发生优势积累，1例感染野株者演变为BCP变异株，未发现A83变异株感染；②HBeAg持续阴性者7例：研究开始时3例为A83变异株感染，3例为BCP变异株感染；结束时发现，1例感染野株者演变为BCP变异株，原感染BCP变异株者，2例为变异株持续感染，1例BCP变异株在第一个ALT高峰后消失；原感染A83变异株者，2例为变异株持续感染，1例变异株消失。③HBeAg由阳转阴者13例：研究开始时，1例为A83优势株感染，5例为BCP变异株与野株混合感染，7例为野株感染；随访结束时，2例HBV DNA消失，3例为A83变异株感染，5例为单一BCP变异株感染，3例BCP和A83同时变异；两种变异的优势积累均发生在HBeAg阴转之前(图2)。④HBeAg血清学反复者6例：开始时，2例为单一BCP变异株感染，3例为BCP变异株混合感染，1例HBV DNA阴性；在随访期间，2例BCP单一变异株感染者，表现为变异株持续感染，其HBeAg血症仅在ALT高峰时出现；其他4例中，2例发展为单一BCP变异株感染，2例同时感染有BCP和A83变异株。