关键词: 人乳头瘤病毒；YY1；C127细胞；转化

【摘要】目的人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)16型早期启动子P97控制着病毒癌基因的表达。为了观测长控制区(Long control region, LCR)上YY1结合位点的破坏对病毒转化能力的影响。方法构建了带有自然发生突变LCR序列的HPV16全基因质粒，利用EMSA和荧光素酶实验检测小鼠纤维细胞胞核内源性YY1蛋白存在和功能状态；将标准及突变的HPV16毒株转染至C127细胞进行软琼脂糖培养基生长实验。结果与上皮类细胞相似，在C127胞核提取物中可检出YY1蛋白，并且具有良好的DNA结合功能和P97活性抑制作用。转化实验显示YY1位点突变HPV16毒株可在软琼脂糖培养基上形成2～10倍量多的生长集落。结论细胞转录调节因子YY1存在于啮齿类动物纤维细胞胞核中；LCR上YY1结合位点的破坏可在完整基因组范围内明显增强病毒对小鼠纤维细胞的转化能力。

Removal of YY1 binding sites in HPV 16 LCR increases viral transforming activities on mouse fibroblastsDONG Xiaoping, LIU Hong, H. Pfister. Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of removal of YY1 binding sites within the LCR region of HPV 16 on viral transforming activity.MethodsPreviously we had generated new plasmids carrying HPV 16 whole genome, which contained naturally occurred mutated LCR sequences. The viral transforming abilities on mouse fibroblasts were evaluated in anchorage-independent assays, while the expression and activity of YY1 protein in fibrobalsts were tested with EMSA and luciferase assays.ResultsYY1 protein was expressed in mouse fibroblasts C127, with ability for DNA binding and repression on P97 activity. Both HPV 16 wild-type DNA and mutated DNAs were transfected into C127 cells and spread to the soft-agarose mediums after selecting with G 418. The growth numbers of the cells transfected with mutated HPV 16 DNAs were 2-10 fold more than that with wild-type HPV 16 DNA.ConclusionLike in epithelial cells or cell lines, transcription regulator YY1 is widely expressed in rodent fibroblasts. Removal of YY1 binding motifs can elevate in the context of the whole genome, the anchorage independent growth ability and the transforming capacity of HPV 16 on the mouse fibroblasts.

【Key words】Human papillomavirusYY1C127 cell lineTransforming

人乳头瘤病毒16型为“高危”肿瘤相关病毒，主要与生殖器、道，肛门区域的恶性肿瘤发病有关。病毒的癌基因主要包括病毒早期开放阅读框架(Open reading frame, ORF)E6区和E7区。高危HPV E6蛋白可与肿瘤生长抑制因子p53结合，导致p53蛋白的降解^［1］。E7蛋白具有与其他癌基因产物，如腺病毒E1A，SV40大T抗原相类似的序列结构，可同肿瘤抑制蛋白pRB结合^［2］。E7蛋白本身或与E6蛋白、以及其它癌基因协同作用可使原代角源细胞，纤维细胞，上皮细胞发生永生化^［3-5］。HPV 16 E6/E7基因的表达受病毒早期启动子P97的控制，而细胞转录调节因子YY1可通过结合至位于病毒长控制区的特异性结合位点对P97的活性起抑制作用^［6-8］。我们曾经报道自然发生的YY1结合位点的破坏可在整个LCR范围内诱导P97活性增强^［6，7］。为了观测YY1位点的破坏在整个病毒基因组的情况下对病毒转化能力的影响，我们构建了带有特异性突变LCR的HPV 16全基因组质粒^［9］，已证实YY1位点突变的HPV 16 可在短暂转染中引起E6 mRNA的转录增强^［10］。本研究观测了新组建的突变HPV 16 基因组对啮齿类支物纤维细胞转化能力的影响。

1材料和方法

1.1质粒p1203系P.Howley博士惠赠，为HPV 16野毒株全基因组质粒^［11］。pDV390和pDV1326为带有突变LCR序列的HPV 16全基因组重组质粒，其构建过程如前所述^［9］。

1.2细胞培养及转染小鼠纤维细胞C127在含有10%FCS的DMEM培养液中生长。转染采用Lipofact AMINE法。5 μg质粒DNA，1 μg pSV-neo DNA15 μl LipofactAMINE在200 μl无血清、无抗菌素的DMEM培养液中室温作用30分钟后滴加至70%生长丰度的60 mm细胞培养皿中，16小时后换液。

1.3C127胞核提取物的制备收集生长丰度95%左右的单层培养细胞(100 mm培养皿)，PBS洗2次。加1 ml胞核裂解液^［7］冰上作用1 h。15 000 r/min 4℃离心30 min收集上清。蛋白定量后-80℃保存。

1.4EMSA所用双链寡核苷酸片段Oligo-WT为HPV 16 LCR(nt 7 836-7 875)序列，其中带有一个启动子近端YY1结合位点(nt 7 840-7 848)^［6］。Oligo-PM为相同的HPV 16 LCR序列含有一nt 7 834位点的A→G突变^［6］。探针标记采用末端标记法，500 ng oligo与20 μ Ci γ-³²P-ATP混合，在T4 DNA多聚酶的作用下37℃反应1小时，酒精沉淀纯化。20 000-40 000 Cerenkov cpm标记之oligo与0.5 μg HIS-YY1蛋白、5 μg细胞核提取物在300 μg/ml牛血清白蛋白、5 μmmol/L DTT、10 μmmol/L亚精胺和0.5～1.0 μg dIdC条件下室温反应20 min, 行4%非变性PAGE电泳区分未结合之游离探针。PAGE胶经真空抽干后行放射自显影。

1.5细胞G418筛选C127细胞在转染48小时后经胰酶消化后以1×10⁶的浓度传至另一60 mm培养皿。细胞长至约60%丰度时换含有800 ng/ml G418的DMEM进行筛选。3～4周后出现细胞生长集落，经1%亚甲蓝染色统计生长集落。

1.6细胞软琼脂培养基生长实验将经G418筛选的生长细胞胰酶消化后，按1×10⁵的浓度传至0.6%的软琼脂培养基(2×MEM/1.2% agarose ⅢⅤ，v/v:50/50)上。每隔4天添加1 ml 0.3%的软琼脂培养基。4周后光镜下观测软琼脂培养基细胞生长克隆，以有16个生长细胞的集落为阳性克隆。

1.7荧光素酶测定荧光素酶报告质粒pH16 luc,pT390-luc pT1 326-luc构建如前所述^［6］。细胞转染及荧光酶测定按常规方法进行^［6］。

2结果

2.1小鼠纤维细胞中带有良好生物学活性的YY1蛋白YY1蛋白广泛存在于人类及啮齿类动物上皮细胞胞核内。为了观测由于YY1特异性结合位点破坏是否可影响HPV 16全基因组对小鼠纤维细胞转化能力，我们首先测定YY1蛋白在C127细胞中的存在情况。EMSA实验表明C127细胞核提取物与经³²P标记的带有YY1位点的Oligo WT反应后在相应泳动部位形成蛋白-DNA复合物，而这一复合物在与同带有突变YY1位点的Oligo PM反应时消失(图1)。这提示在C127细胞核内存在有良好DNA结合功能的YY1蛋白。进一步我们将带有标准以及YY1结合位点突变的HPV 16 LCR序列的荧光素酶报告质粒转染至C127细胞进行荧光素酶测定。结果显示带有缺损突变的质粒pT1 326-luc可诱导 6.9倍的荧光素酶表达增加(图2)，这同在上皮细胞中的结果相似^{［6，7，12］}。而带有点突变LCR的质粒pT390-Luc仅引起1.46倍的P97活性增加，明显低于在上皮细胞中的诱导增强效应^{［6，7，12］}。

图1YY1蛋白存在于小鼠C127细胞胞核中

YY1箭头所示为YY1 DNA复合物；F箭头所示为未结合的³²P标记探针；

表示C127胞核提取物浓度递增

Fig.1YY1 protein presents in the nuclear extracts of mousefibroblasts C127

YY1 arrow shows the specific YY1-DNA complexes. F represents the unbound ³²P labeled probe. represents the increasing concentrations of the nuclear

extracts of C127

图2YY1结合位点缺损可在C127细胞中诱导P97活性增加,

所获的相对荧光素酶表达值为3次不同转染结果的均值

Fig.2Removal of YY1 binding sites in the contest of the

LCR region increased P97 activity in C127 cells.

The values of the relative luciferase expression were the

averages from three different transfections

a: pH16-luc. b: pT390-luc. c: pT1326-luc

2.2YY1结合位点的破坏可在全基因组范围内诱导增强对鼠纤维细胞的转化能力为了观测LCR区域