关键词: 庚型肝炎；动物模型；肝脏；免疫组化

【摘要】目的探讨庚型肝炎(HG)发生、发展规律及庚型肝炎病毒(HGV)的致病机理。方法用1例临床和病理确诊的单独HGV RNA阳性的慢性肝炎患者血清1次或多次分别静脉攻击中国恒河猴，观察攻击前、后动物血清学和肝组织学的动态变化，同时用HGV nS5区抗原制备的单克隆抗体进行肝脏组织免疫组化检测，并于感染后第18个月活体解剖1只雄性猴，取各种脏器观察组织学结构。结果动物感染后第30天血清ALT、AST开始升高，并持续异常达9个月之久；感染后第2个月肝组织出现点状、灶性及轻度碎屑样坏死并持续受损达18个月；HGV抗原定位呈肝细胞胞浆型；HGV感染后第18个月，除肝脏组织呈慢性病毒性肝炎改变外，其它脏器未见异常。结论HGV感染中国怛河猴初步建立，为进一步研究庚型肝炎提供了较合适的动物模型。

Dynamic observation of serological and histological changes of Chinese rhesus monkeys infected by hepatitis G virusXU jiazhang, JU Jiulong, yANG Zhiguo, et al. Institute of Liver Disease, 81 st Hospital of PLA, Nanjing210002

【Abstract】ObjectiveTo study the genesis, development and pathogenesis of hepatitis G.MethodsThe Chinese Rhesus monkeys were intravenously injected with the serum from a hepatitis G patient only with hGV RNA positive. The dynamic changes of serum and liver tissues of the animals were observed before and after infection. Also the immunohistochemical study were done with monocolonal antibody against NS5 gene antigen of HGV. One male monkey was dissected and the internal organs were taken for histological examination18 months after infection.ResultsSerum ALT and AST became increasing30 days after infection and showed abnormal continously for 9 months. Spotty and focal necrosis and piecemeal necrosis were found in liver tissue from 2 to 18 months after infection. Positive staining of HGV antigen was present in cytoplasm of liver cells by immunohistochemistry. Histological observation showed that the internal organs were normal except the liver tissue in which the damages were similar with that in hepatitis.ConclusionThe successful infection of Chinese Rhesus monkey by serum from hepatitis G patient can used as a good animal model for the study of hepatitis G.

【Key words】Hepatitis GAnimal modelLiverImmunohistochemistry

庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C)是1995年Simmons和Linnen等^［1，2］首次确认的新型肝炎病毒，迄今为止的研究表明，HGV是单股正链RNA病毒，全世界均有分布^［3］。为探讨HGV的致病性，观察庚型肝炎(HG)发生、发展规律，我们成功地建立了中国恒河猴庚型肝炎病毒感染的动物模型。

1材料和方法

1.1实验动物来源中国云南健康恒河猴雄雌各1只，年龄2～2.5岁，体重2.5～3.0 kg，购自中国科学院动物研究所。编号：雄性猴94073，雌性猴94070。

1.2HGV血清来源从1例经临床和病理确诊的单一HGV感染的慢性庚型肝炎患者(其血清HGV RNA持续阳性1年)采血50 ml分离血清无菌封口，-25℃保存备用。

1.3感染动物的方法用氯胺酮麻醉实验动物(1 mg/kg)后，静脉采血1～2ml，同时行肝脏活检，然后用HGV RNA阳性血清3 ml静脉注射雄性猴，每15天1次，共3次；用10 ml阳性血清给雌性猴一次性静脉注射。2只动物分别于注射后第0.5，1，2，3，6，9，12，18个月采血检测ALT、AST、HGV RNA，同时行肝组织活检，并于感染后第18个月活体解剖雄性猴，心脏放血后取肝、脾、心、肺、肾等组织进行光、电镜检查。

1.4肝组织免疫组化检测HGV NS5区单克隆抗体(琼脂扩散效价1：50～1：100)由军事医学科学院五所馈赠，具体操作步骤参见文献［4］。

1.5血清学检测用自动生化分析仪检测ALT和AST；用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测HGV RNA，引物取自HGV-5^，非编码区，扩增片段为170 bp，试剂由军事医学科学院五所馈赠。

1.6组织学检测肝穿活检组织一部分固定于10% 福尔马林中，作常规石蜡切片，HE染色，光镜观察。一部分固定于4%戌二醛液中，作电镜观察。

2结果

2.1HGV血清攻击前后实验动物血清ALT和AST的动态变化图1包括HGV阳性血清多次攻击雄猴后的检测结果。攻击前ALT和AST分别为13U/L和8U/L，首次攻击后第30天ALT和AST分别升高至31U/L(为攻击前自身对照的2.4倍)和53U/L(6.6倍)，持续异常至第9个月开始下降，第12个月ALT降至攻击前水平，AST为25U/L，第18个月AST仍达20U/L；图1也包括雌猴的血清学检测结果，第15天ALT和AST开始升高，第30天分别升高到攻击前水平的3.9倍和5.6倍，并且持续异常，第6个月开始出现ALT下降，第9个月仍高达2.2倍和4.9倍。同时观察了血清HGV rNA的变化，第30天、第90天血中均检出HGV RNA，经cDNA克隆及序列分析，证实HGV感染动物成功。

图1感染HGV后雄猴和雌猴血清ALT和AST

的动态变化

Fig.1Serum ALT and AST dynamic changes of HGV

infected male and famale monkeys

2.2肝脏组织学的变化及免疫组化检测结果在注射HGV阳性血清之前，两只实验动物肝活检组织光镜观察显示正常肝小叶结构；注射后第15～30天肝细胞浊肿，第60天肝组织出现轻度点状坏死及灶性淋巴细胞浸润，汇管区还有轻度碎屑样坏死(图2)，第120天肝组织点状，灶性坏死更为明显。电镜观察结果：第15～30天肝细胞主要改变为线粒体肿胀，第60天肝细胞除线粒体肿胀、糖原明显增多外，部分核出现深浅不一的切迹，异染色质增多，呈块状，少数核呈固缩状，粗面内质网扩张；第60天狄氏间隙中胶原纤维增生，有伸入到肝细胞之间及病变的肝细胞胞质中(图3)。HGV感染中国恒河猴第18个月，实验动物活体解剖组织学显示心、脾、肺、肾、胃、小肠及胰腺组织未见明显病变。肝细胞显浊肿，少数肝细胞呈嗜酸性变，可见点状及灶性坏死和灶性淋巴细胞浸润，轻度碎屑样坏死，汇管区还有少量到中量淋巴细胞浸润；电镜观察少数肝细胞核出现深浅不一的切迹，使核缘呈锯齿状，异染色质增 多，粗面内质网扩张，线粒体肿胀，狄氏间隙中贮脂细胞轻度增生，胶原纤维增生，有些伸入肝细胞间及受损的肝细胞质中，毛细胆管部分扩张，微绒毛掉失。病理诊断：慢性病毒性肝炎。肝组织HGV抗原免疫组化染色，于HGV阳性血清攻击后第30天呈阳性，HGV抗原定位于肝细胞胞浆内，DAB染色呈棕色或棕黄色颗粒状，阳性细胞数量少且分散(图4)。

图2汇管区肝细胞界板有轻度破坏，呈轻度碎屑样坏死。×420，HE。

Fig.2Slight damage of hepatic lobule adjacent and piecemeal necrosis were shown in portial area. ×420, HE

图3狄氏间隙胶原纤维增生并伸入到受损的肝细胞质中。×1500，EM。

Fig.3Proliferation of collagen fiber was occured in Dissi's space and extended into cytoplasm of the damaged hepatocytes. ×1 500, EM

图4HGV感染后第30天肝穿组织，经特异HGV McAb染色，HGV抗原定位于肝细胞胞浆，阳性染色呈棕黄颗粒状。×1000，BA。

Fig.4The liver tissue 30 days after HGV infection showed HGV antigen locating in liver cell cytoplasm, positively stained by specific HGV McAb as brown-yellow granules. ×1 000, BA

3讨论

目前关于HGV研究争论的焦点是HGV能否单独致病。一部分研究者认为，HGV与暴发性肝炎^［5］、肝硬变、肝癌及原因不明的肝硬变有关，HGV可能在肝细胞内复制^［6］；而另一部分研究者的看法恰恰相反^［7］，这些截然不同的结论使得HGV的研究复杂化。分析其原因，一是各家选择研究对象的标准不一，采用的研究手段不同；二是大量的研究均局限于血清学，缺乏组织学的标本；三是研究发现HGV病例多为重叠其它肝炎病毒