关键词: 聚合酶链反应；登革病毒；蝙蝠

【摘要】目的寻找中国海南岛一带登革热疫区，登革病毒潜伏的动物宿主及鉴定其毒株型别。方法采用1-4型登革病毒通用引物，用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测海南岛登革热流行区蝙蝠脑细胞，血清和埃及伊蚊的登革病毒RNA。结果检测35例疫区蝙蝠脑细胞，20例阳性；检测18例蝙蝠血清，3例阳性；检测三组埃及伊蚊，1组阳性，3组非流行区者都阴性。用4个登革病毒原型株的单克隆荧光抗体技术检测20例登革病毒RNA阳性的蝙蝠脑细胞压印片，16例为2型株阳性，与RT-PCR检测登革热流行区登革病毒RNA阳性蝙蝠脑细胞的阳性符合率为80.00%。用RT-PCR检测非流行区蝙蝠脑细胞登革病毒RNA，均为阴性。结论本研究证实蝙蝠是登革病毒的贮存宿主，为登革热流行的有效控制提供了一定重要的线索。

Detection of Dengue virus genome RNA in some kinds of animals caught from Dengue fever endemic areas in Hainan Island with reverse transcription-polymerase chain reactionZhang Haoyan, Yang Xinke, Li Guiying, et al.Beijing Tropical Medicine Research Institute, Beijing 100050

AbstractDetection of dengue virus genome RNA in brain of bats caught from dengue fever endemic areas in Hainan Island were carried out with reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR). Positive result was demonstrated in 20 of 35 bats tested, with a positive rate of 57.14%; RT-PCR was applied for the detection of dengue virus genome RNA in sera of bats caught from the endemic areas in Hainan Island, 3(16.66%)of 18 sera were positive. Dengue virus genome RNA in female Aedes aegypti captured from dengue fever endemic areas in Hainan Island was detected by using RT-PCR, 1(33.33%) of 3 lots was positive. Similar examinations on bat brains and mosquitoes captured from non-endemic areas were all negative. In addition, monoclonal IgG antibodies against types 1-4 dengue viruses were added onto brain imprints of bats captured from endemic areas of dengue fever in Hainan Island, 16(80.00%) of 20 showed positive results for type 2 dengue virus antigen by direct immunofluorescent assay. The antibodies to various types of dengue virus were coincided to that of dengue virus genome RNA. The above results proved that bat is the reservoir of dengue virus, and this provides an important clue for the effective control of dengue fever epidemics in endemic areas.

Key words:Polymerase chain reactionDengue virusBat

1978-1990年间，中国海南岛和华南沿海地区发生几次较大的登革热流行。1990年以后，本病又以散发或局部流行形式出现。有些地区，在一次登革热流行中同时查见两种型别的登革病毒，这可能与1990年以前在这些地区流行的登革病毒株潜伏在疫区中某些动物体内有关。为寻找登革病毒的动物宿主，我们做了以下工作。

1材料和方法

1.1标本采集及病毒原型株来源

1.1.1蝙蝠1980～1982年和1986～1991年海南岛周边沿海地区发生登革热流行，每次流行发病达几十万人，引起这两次流行的登革热的病原分别为3型和2型登革病毒。1995年8月在海南岛登革热流行区山口乡美文村椰子树上捕捉了棕果蝙蝠。用无菌操作收集了蝙蝠脑细胞充分研磨制成悬液。置-70℃保存备用。

1.1.2埃及伊蚊将捕获的埃及伊蚊，选出雌性蚊剪去触角、须、四肢和翼。用无菌生理盐水洗3次。弃去盐水，将蚊体研磨成悬液，用非流行区捕捉的雌性埃及伊蚊悬液作对照。

1.1.3病毒登革病毒四个原型标：1型Hawaii株(CDC)，2型New Guinea株(CDC)，3型H87株(CDC)和4型H241株，均为1978年自法国巴斯德研究所引入。使用前用1～3天新生小白鼠脑内接种传代，毒力增强后用作病毒对照。乙型脑炎病毒由中国预防医学科学院病毒学研究所赠送。

1.1.4病人血清标本收集1988～1993年海南岛登革热流行区临床诊断为登革热的病人血清44份用于登革病毒IgM抗体测定。

1.2引物设计与合成参照文献［1～4］报道，自行设计了一对通用引物，序列为5’端引物：5’-GTGCACACATGGACAGAACA-3’，GC为50%；3’端引物：5’-CTTTCTATCCAATAACCCAT-3’，GC为31%。靶序列(基因)NS1，基因片段539 bp。此对引物由中国预防医学科学院病毒学研究所合成，扩增片段长539 bp。

1.3病毒RNA的提取和纯化每份标本200μl，裂解液，磨碎。加入NaAc 20μl，饱和酚200μl，氯仿：异戊醇(49：1)40μl，混匀，水浴65℃ 15min，15000r/min 5min；取上清，加入等体积异丙醇，-20℃过夜，15000r/min离心10min；取其沉淀加入裂解液20μl，异丙醇20μl，置-20℃过夜，15000r/min离心15min；将沉淀用75%乙醇洗2次，抽干；加入0.5%SDS溶液100μl，65℃ 10min，放-20℃保存。

1.4RT-PCR病毒RNA逆转录试剂盒由Promega公司出售，按操作说明进行实验。Taq酶为加拿大Biostar公司产品。其操作方法为：取10×Taq酶缓冲液2μl，Primer Ⅰ 5μl，Primer Ⅱ 5μl，dNTP 2μl，模板6μl，AMVE0.5μl，RNaSin0.1μl，混匀，置42℃60min，95℃5min。立即置冰浴中，每管补加0.5μl Taq酶，然后扩增，94℃ 1min(变性)，55℃ 1min(退火)，72℃ 1.5min(延伸)，经30个循环，再经72℃ 7min。

1.5扩增产物检测和分析充分混匀反应产物，吸取10μl放在1.5%琼脂糖凝胶中作电泳，以溴化乙锭染色法在UV-1三用紫外分析仪下观察扩增结果。

1.6流行区登革病毒型别鉴定用1-4型登革病毒单克隆荧光抗体技术，检查RT-PCR阳性的蝙蝠脑细胞压印片，每例蝙蝠脑细胞制作压印片12张，分别吸取抗1、2、3、4型登革病毒单克隆荧光抗体(军事医学科学院五所闫国珍教授增送，滴度均在10240以上)，加到蝙蝠脑细胞压印片上，每型病毒单克隆荧光抗体溶液滴加3张脑细胞压印片，放在潮湿的大平皿中，然后将平皿置37℃保温45min，取出，用PBS洗涤3次，将水吸干后，用Olympus荧光显微镜检查。以同样方法做阳性和阴性对照。

2结果

2.1通用引物扩增登革病毒RNA特异性试验使用登革病毒通用引物作PCR，扩增1、2、3、4型登革病毒原型株RNA，每一型别均出现一条明亮的扩增条带，扩增基因片的大小为539 bp左右。以此通用引物进行PCR扩增乙型脑炎病毒RNA，没有出现一条明显的扩增条带。表明本研究采用的通用引物检测登革病毒RNA具有高度的特异性。见图1。

图1RT-PCR产物的1.5%琼脂糖凝胶电泳分析

M：pBR322/Hinf Ⅰ；1：非流行区蝙蝠脑组织(阴性对照)；2：日本脑炎病毒(JEV)；3：2型登革病毒；4：3型登革病毒；5～14：蝙蝠脑标本

Fig.1Analysis of RT-PCR products with 1.5% agarose gel electrophoresis

M:pBR 322/HinfⅠ; 1:Bats captured from non-endemic areas(negative control); 2:Japanese encephalitis virus (JEV); 3:Type 2 dengue virus; 4:Type 3 dengue virus; 5-14:Bat brain specimens

2.2 通用引物扩增登革病毒RNA的灵敏性试验以不同浓度的登革病毒RNA为模板，以通用引物进行PCR扩增，然后用1.5%琼脂糖电泳，50fg的登革病毒RNA模板可产生清晰可辨的扩增条带。

2.3登革热流行区蝙蝠脑细胞和血清中登革病毒RNA检测用通用引物进行RT-PCR检测流行区蝙蝠脑细胞35例登革病毒RNA，阳性20例；检测18例流行区蝙蝠血清的登革病毒RNA，阳性3例。检测非流行区蝙蝠脑细胞3例，结果均为阴性。

2.4埃及伊蚊登革病毒RNA的RT-PCR检测结果从海南岛登革热流行区捕捉的雌性埃及伊蚊3组，每组10只，用RT-PCR检测蚊体研磨悬液的登革病毒RNA，有1组阳性。用从非流行区捕捉的雌性埃及伊蚊作对照，以同法检测，结果为阴性。

2.5登革病毒分型诊断吸取1～4型登革病毒单克隆荧光抗体分别滴加在20例RT-PCR阳性的蝙蝠脑细胞压印片中，经染色和PBS洗涤后，可用荧光显微镜检查，可观察到用2型登革病毒单克隆荧光抗体染色的蝙蝠脑压印片细胞胞浆出现特异性荧光的16例，为阳性。RT-PCR检测阳性的与单克隆荧光抗体检查阳性的符合率为80.00%。以同样方法做阳性对照和阴性对照。阳性对照的小白鼠脑细胞胞浆出现特异性荧光。阴性对照的非登革热流行区捕捉的蝙蝠脑细胞胞浆没有出现特异性荧光。

2.6登革热流行区病人血清抗体的测定采用单克隆抗体ELISA捕捉登革热病人特异性IgM，定性试验阳性者，再与阳性型别的抗原作定量试验，对阳性血清用2-巯基乙醇处理，以判别IgM。用单克隆抗体ELISA<