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【摘要】目的为了检测YY1在不同宫颈癌细胞及人乳头瘤病毒易感细胞中的表达、功能状态和YY1位点破坏所诱导的P97活性增强效应。方法提取了4种宫颈癌细胞和2种人角源细胞胞核蛋白，检测其内源性YY1蛋白。同时将带有HPV 16标准LCR和YY1位点突变LCR序列的荧光素酶质粒短暂转染上述细胞以检测P97活性。结果所有被检细胞均含有良好生物学活性的YY1蛋白，其蛋白含量在各细胞系间无明显差别。HPV 16 LCR上YY1位点的破坏可在多种细胞，包括人类原代角源细胞中诱导P97活性增强。结论表明YY1蛋白调节系统广泛存于HPV易感细胞系内。同时我们还发现转录激活因子NF1在C33a细胞中的含量明显高于HT3细胞，并影响YY1位点改变所致的P97活性增强效应。这提示在不同的细胞系中活性蛋白的表达和含量可能不同。
YY1 and its repressive effect on human papillomavirus 16 early promoter P97 exist ed widely among human epithelial cell lines Dong Xiaooping,Liu Hong,Herbert Pfister.Institute of Virology,Chinese Academy of Preventive Medicine,Beijing 100052
AbstractCellular transcription factor YY1 represses the activity of early promoter P97 of HPV 16.Removal of the specific binding sites for YY1 in HPV 16 LCR can increase the P97 activity.To analyse the expression of YY1 and the existence of the activation effect on P97 due to removing YY1 binding sites inthe LCR region,we extracted nuclear proteins from four cervical cancer cell lines and two human keratinocytes.EMSA assays were carried out in vitro.At the same time, we transiently transfected the luciferase reporter plasmids,which contain HPV 16 reference and mutated LCR sequences,respectively,into the different cells and determined the luciferase expressions.The results showed that all the analysed cell lines contained biologically functiona1 YY1 proteins.No remarkable difference in the concentration of native YY1 proteins could be detected among the tested cells.Removal of YY1 binding sites in HPV 16 LCR could elevate P97 activity in several analysed celll lines,including normal human primary keratinocytes from foreskin.lt suggests that YY1 regulatory system exists widely in human epithelial cell lines. We also found that the transcription activator NF1 was more highly expressed in C33a cell than in HT3 cell,indicating an unevenly distribution of functional proteins in various cell lines.
Key words:YY1Human papillomavirusP97NF1
细胞转录调节因子YY1属GLI-Klueppel蛋白，在多种细胞和病毒启动子调节区域都有其特异性结合位点。根据启动子结构的不同YY1蛋白可激活或抑制启动子的活性。YY1可抑制腺病毒P5启动子的活性，而其抑制作用可被腺病毒早期蛋白E1A逆转〔1〕。YY1可抑制Epstein-Barr(EB)病毒BZLF-1启动子活性〔2〕并对人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)的转录和病毒装配起负性调节作用〔3〕。YY1可增强单纯疱疹病毒1型结构蛋白启动子活性〔4〕。此外YY1与SP1蛋白协同可诱导腺病毒P5启动子转 录起始〔5〕。
在人乳头瘤病毒16型(Humanpapilloma-virus type16,HPV16)长控制区(Long control region, LCR)上存在有多个YY1结合位点。YY1蛋白通过结合至相应位点抑制早期启动子P97活性〔6～8〕。YY1位点的突变及缺失可在宫颈癌细胞系HT3中诱导3.5～6.7倍的P97活性增强。为了进一步观测在其它HPV易感细胞系中YY1的表达及YY1位点破坏引起的P97活性增强效应的存在情况，我们提取了6种人类上皮细胞核蛋白进行内源性YY1的检测，同时进行P97活性的测定。
1材料和方法
1.1质粒所用荧光素酶表达质粒为pA-luc〔6〕。pH16-luc带有HPV 16 原毒株LCR序列(nt 7 004-123)。pT390-luc为相同长度的HPV 16 LCR 序列含有一nt7796位G→A的突变，该突变破坏了一个启动子远端YY1位点(nt 7 791-7799)的YY1蛋白结合能力。pT1326-luc带有一115 bp的缺失突变，除去了两个YY1结合位点〔6〕
1.2HIS-YY1的纯化HIS-YY1融合蛋白表达质粒pHIS-YY1系Dr.T.Shenk惠赠〔1〕。将带有pHIS-YY1质粒的大肠杆菌E.coli RR菌株活化培养至吸光度A值(600nm)约0.4时，加1μmol/L IPTG诱导蛋白表达。4℃离心收集细菌，以呱嘧啶-盐酸法裂解〔6〕。裂解物变性后经NTA＋-agarose亲和层析柱分离纯化。洗脱液复性后经SDS-PAGE电泳，EMSA鉴定，-80℃保存。
1.3细胞培养及转染子宫颈癌细胞系HT3，HeLa,C33a及SiHa细胞，人角源细胞HaCat在含10%的小牛血清的DMEM培养液中生长。人原代包皮角源细胞(Human primary keratinocyte from foreskin,HKfF)在无血清角源细胞培养液(PromoCell公司产品)中生长。对HT3，HeLa,C33a，及HaCat细胞转染采用磷酸钙法〔7〕，2μg质粒DNA，0.5μg pRSV-β-gal DNA同250mmol/L CaCl2，1×HBS缓冲液(280mmol/L NaCl,10mmol/L KCl,1.5 mmol/L Na2HPO4,50mmol/L HEPES)室温作用20分钟。对SiHa和HKfF细胞转染采用LipofectAMINE法，2μg质粒DNA，0.5μg pRSV-β-gal DNA同10μl LipofectAMINE(Gibco公司产品)室温作用30分钟。将作用后的DNA滴加至60mm约70～80%生长丰度的单层细胞培养皿中，次日PBS洗后换液。转染48小时后收集细胞，经4次反复冻溶，离心收集上清。
1.4胞核提取物的制备收集生长丰度95%左右的单层培养细胞(100mm培养皿)，PBS洗两次。加1ml胞核裂解液〔7〕冰浴30分钟，离心收集沉淀之细胞核。加0.1ml胞核蛋白洗脱液〔7〕冰浴1小时。15 000r/min,4℃离心30分钟收集上清。蛋白定量(BIO-RAD公司蛋白定量试剂)后-80℃保存。
1.5EMSA所用双链寡核苷酸片段Oligo-WT为HPV 16 LCR(nt.7836-7875)序列，其中带有一个启动子近端YY1结合位点(nt 7840-7848)〔6〕。Oligo-PM为相同的HPV 16 LCR序列含有一nt7843位的A→G突变〔6〕。Oligo-NF为HPV 16 LCR序列(5’-CCTAATTGCATATTTGGCATAAGG-3’，nt 7728-7748)含有一个NF1结合位点。探针记采用末端标记法，500 ng Oligo与20μCiγ-32P-ATP混合，在T4DNA 多聚酶的作用下37℃反应1小时，酒精沉淀纯化。将20 000-40 000 Cerenkov cpm标记之Oligo与0.5μgHIS-YY1蛋白、5μg细胞核提取物在300μg/ml牛血清白蛋白、5μmol/L DTT、10 μmol/L亚精胺和0.5～1μg dIdC的条件下室温反应20分钟，行4%非变性PAGE电泳区分未结合之游离探针。PAGE胶经真空抽干后行放射自显影。竞争抑制试验中所用Oligo-AVV为腺样病毒DNA序列(5′-AGGGTCTCCATTTTGAAGCGGG-3′)。Oligo-T7为E.coliT7启动子序列(5′-TCGATAATACGACTCACTATAGGGAGAGATC-3′)。YY1特异性多克隆抗体为Dr.T.Shenk惠赠。与32P标记的Oligo反应之前，HIS-YY1蛋白及胞核蛋白先与50及400倍的未标记竞争Oligo以及0.5～3.0μl抗体反应20分钟。
1.6荧光素酶(luciferase)检测取10～20μl转染细胞提取物加至100μl测定液(0.1mmol/L K2PO4，15mmol/L MgSO3，50mg/ml ATP)在荧光素酶测定仪内与10ng D-luciferin(Boehringer公司产品)反应10秒钟，自动测定荧光素酶数值。取20-30μl细胞提取物与30μl 0.4μg/ml ONPG(Sigma公司产品)37℃作用1时，420nm测定的A值为β-gal表达数值。荧光素酶表达值为荧光素酶值/β-gal值之比。
2结果
2.1YY1蛋白广泛分布于人上皮细胞胞核内YY1蛋白被认为是广泛存在于人和动物细胞核内的转录调节因子。为了进一步观测在HPV易感的角源细胞和宫颈癌细胞中YY1蛋白的存在情况，我们提取多种细胞核蛋白与经32P标记的、带有YY1结合位点的HPV 16 LCR双链DNA片段进行体外结合试验。以前实验已证实位于YY1位点内的A→G突变(nt 7843)可破坏该位点的YY1蛋白结合能力〔6〕。图1显示所有的被验细胞核提取物均可同Oligo-WT形成多个蛋白-DNA复合物，其中复合物D与HIS-YY1蛋白形成的复合物泳动速度相似。而这一复合物在与Oligo-PM的反应时消失。这提示复合物D的形成可能是由于内源性YY1蛋白所致。此外我们还发现在等量胞核提取物的条件下，各种细胞的内源性YY1蛋白在含量上无明显差异(图1)。与HIS-YY1蛋白形成的特异性复合物在泳动速度上的差别是由于HIS-YY1融合蛋白的分子量大于内源性YY1蛋白。为了进一步确定复合物D确系细胞内源性YY1蛋白所致，我们将HeLa细胞胞核提取物与带有YY1特异性结合位点的同源Oligo-AAV及非同源Oligo-T7行竞争性抑制试验。图2A显示，在400倍未标记的Oligo-AAV存在下复合物D条带消失。而在有等量未标记的Oligo-T7时所有复合物条带均未受明显影响。抗体抑制试验也显示，在YY1特异性抗体存在下复合物D条带消失(图2B)。这些结果证实复合物D确
