关键词: 聚合酶链反应；人细小病毒B19；自然流产

【摘要】目的进一步了解我国胎儿人细小病毒B19的感染状况及其与自然流产之间的关系。方法用所建立的套式聚合酶链反应(PCR)技术对50例新鲜的和66例石腊包埋的自然流产组织及25例同期健康孕妇人工流产组织进行人细小病毒B19 DNA检测。结果显示病例组有34例阳性，阳性率为29.3%，而正常对照组有1例阳性，阳性率为4%。经统计学检验有显著性差异。结论可能人细小病毒B19感染与自然流产有一定关联。人细小病毒B19可能是致自然流产的重要因素之一。

The study on detection of human parvovirus B19 DNA in spontaneous abortion tissues Xu Dongliang,Zhang Guocheng, Wang Rongping. Department of Pedicatrics of Xijing Hospital,Xian710032

Abstract116 spontaneous abortion tissues were detected for human parvovirus B19 (HPV B19)DNA by nested polymerase chain reaction. Of the abortion tissues detected,66 were paraffin embedded and 50 were fresh abortion tissues,At the same time,25 abortion tissues from healthy artificial abortion women were collected as control. The results showed that 27.3%(34/116) of 116 spontaneous abortion tissues were positive for HPV B19 DNA,and only 4%(1/25)were positive in the control group,the discrepancy was significant χ²=5.769(P＜0.05).It suggests that there is a relationship between spontaneous abortion and HPV B19 infection.HPV B19 infection may be an important factor in spontaneous abortion.

Key words:Nested polymerase chain reactionHuman parvovirus B19Spontaneous abortion

人细小病毒B19(Human?parvovirus B19,HPV B19),是细小病毒属中同人类疾病密切相关的一种单链、线状小DNA病毒，可引起传染性红斑，一过性再障危象等多种疾病，还可能与非免疫性胎儿水肿、流产、死胎密切相关^［1］，作者已报告我国孕妇及小儿中有HPV B19感染，并从孕妇血中检出HPV B19 DNA^［2，3］。本研究用套式PCR技术检测自然流产组织中HPV B19 DNA，进一步了解我国胎儿HPV B19 感染状况及其与自然流产之间的关系。

1材料和方法

1.1标本病例组50例新鲜自然流产组织采集于1994年4月至1995年4月西安地区五所医院不明原因自然流产的胎儿组织(包括胚胎，绒毛，蜕膜，胎肝等)和66例随机抽取的1991年至1994年西京医院病理科，经石腊包埋的自然流产组织，正常对照组为25例同期健康孕妇人工流产清宫术的胚胎组织。

1.2主要试剂引物按文献［4］设计合成。4对引物的碱基顺序分别为，P1(外引物)5′-CTTTAGGTATAGCCAACTGG-3′，P2(外引物)5′-ACACTGAGTTTACTATGGC-3′，P3(内引物)5′-CAAAAGCATGTGGAGTGAGG-3′，P4(内引物)5′-CCTTATAATGGTGGCTGGG-3′。所对应的碱基位置分别是2905-2924，4016-3997，3187-3206，3290-3271。两对引物扩增产物长度分别为1?112bp和104bp。HPV B19阳性对照模板由沙特皇家医院研究中心(KFSH Research center)提供。Tag DNA聚合酶、4×dNTPS，HSV试剂盒及CMV试剂盒均由华美生物工程公司提供。猫细小病毒，Adv3,Adv7,RSV的来源同文献［2］。

1.3胚胎组织中HPV B19 DNA的提取新鲜组织0.5g剪碎，加入100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA(pH8.0)缓冲液，经组织匀浆后，离心弃上清，加入终浓度为1%的SDS和0.5mg/ml的蛋白酶K，37℃消化48小时，以酚.氯仿.异戊醇(25：24：1)抽提DNA。石蜡包埋的组织先脱蜡，方法是取3张5μm厚切片(切片刀每次切后，均以二甲苯和75%的酒精擦试)放入1.5ml Ependorf管中，加入正辛烷1ml，使石蜡溶解，放室温2小时后离心，100000r/min离心6分钟，再重复1次，使石蜡充分洗脱。脱蜡后组织的酶消化及DNA提取同新鲜组织。

1.4HPV B19的套式PCR的检测同文献［5］。取第2次循环产物经琼脂糖凝胶电泳，紫外分光仪上观察在104bp处出现金黄色电泳带者判为阳性。

1.5鉴别诊断34份HPV B19阳性的自然流产组织，以PCR方法(按试剂盒说明书)检测HSV DNA和CMV DNA。

2结果

2.1套式PCR的特异性和敏感性

将猫细小病毒，AdV3,AdV7,RSV,HSV,CMV和HPV B19，同批作套式PCR及普通PCR，只有HPV B19在104bp处出现电泳带，其余各病毒均为阴性，特异性检测结果见图1。

图1套式PCR特异性

Fig.1The specificity of nested PCR

1∶PGEM-3ZF Hae III.2∶HPV B19 DNA.3∶Cat parvovirus,HSV,AdV3,AdV7,RSV,CMV.9∶Negative control

将HPV B19 DNA分别稀释为每ml含10pg，100fg,1fg,0.1fg,0.01fg及0.001fg，套式PCR可于0.01fg处仍见电泳带，其敏感性可达0.01fg/ml，而普通PCR仅在大于1fg/ml处见到电泳带，说明套式PCR的敏感性比普通PCR大100倍。敏感性实验结果见图2。

图2套式PCR的敏感性

Fig.2The sensitivity of nested PCR

1∶PGEM-3ZF Hae III.2-7：HPV B19 DNA:10pg,100fg,1fg,0.1fg,0.01fg,0.001fg/ml

2.2自然流产组织及正常对照检测结果

116例自然流产组织及25例正常对照组织，经套式PCR检测，结果为50例新鲜自然流产组织有14例阳性，66例石蜡包埋组织有20例阳性，总阳性率为29.3%，而25例健康孕妇人工流产组织中有1例阳性，阳性率4%，经卡方检验，χ²=5.769,P＜0.05，有显著性差异。34例HPV B19阳性标本中有3例HSV阳性，有4例CMV阳性。临床标本中HPV B19的检测结果见图3。

图3临床标本检测结果

Fig.3The detection of clinical specimens

1∶PGEM-3ZF Hae III.2∶Positive control(104bp).3,4∶Positive specimens.5,6∶Negative specimens.7∶Negative control

3讨论

由于人细小病毒B19不能在普通的培养基上生长，抗原来源比较困难，因此血清学诊断受到很大限制，目前基因检测是诊断HPV B19感染的主要方法，PCR技术诊断HPV B19感染始于1989年，其后套式PCR也得了应用^［6］，它通过先对一段较长片段DNA扩增后，特异地对其中一部分片段进行第二次扩增，不仅敏感性提高10～100倍，而且特异性也得到很大的提高。

目前国外已有有关HPV B19感染与自然流产关系的报道，但国内类似的研究较少。国外1988年报道了186例HPV B19感染孕妇有29例自然流产，19例胎儿死亡^［7］。国内于1990通过血清学调查，首次证实我国存在HPV B19的感染^［3］，并对正常新生儿脐血进行特异性抗体IgG测定，对阳性者通过PCR方法检测HPV B19 DNA，未发现阳性^［8］，说明正常胎儿的特异性HPV B19 IgG是通过胎盘由母体获得。本文通过套式PCR技术，检测了116例自然流产组织，25例同期人工流产组织，结果显示：病例组有34例阳性，阳性率为29.3%，而对照组1例阳性，阳性率4%，二者阳性率有显著差异(P＜0.05)。如果不考虑3例HSV和4例CMV阳性标本，或者认为即使存在HSV和CMV，HPV B19也会起作用，则通过本实验可以说自然流产与HPV B19感染有一定关系。但能否可以肯定HPV B19感染为自然流产的原因之一，还有待进一步扩大病例调查，所以要加强对HPV B19流行病学的进一步研究，以便进一步促进我国妇女和儿童的保健事业，提高我国人口质量。

参考文献

1Anand A,Gray E S,Brown T,et al.Human parvovirus infection in pregnancy and hydrops fetalis.N Eng J Med,1987,316:183-186.

2张国成，王绮云，许东亮，等.聚合酶链反应检测人细小病毒B19-DNA.第四军医大学学报，1993，14:463-464.

3王绮云，张国成，金春子，等.西安地区妇女和儿童血清中检出人细小病毒B19抗体.第四军医大学学报，1991，12:134-136.

4Musiani M,Azzi A,Zerbini M,et al.Nested polymerase chain reaction assay for the detection of B19 parvovirus DNA in human immunodeficiency virus patients.J Med Virol,1993,40:157-160.

5王荣平，韩美玉，陈星琪.套式PCR检测胎儿组织人细小病毒B19感染.第四军医大学学报，1995,16:282-284.

6Endman D D,Usher M J,Tsou C,et al.Human parvoviru