关键词: 人免疫缺陷病毒Ⅰ型；gp120；载体；基因表达

【摘要】目的提高人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)包膜糖蛋白gp120基因在原核系统中的表达量。方法采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增出560bp的HIV-1 LAV株gp120N端基因片段，经EcoR?Ⅰ及Sal?Ⅰ酶切后插入高效表达载体pET28a，得到重组质粒pET/120，并转化表达宿主菌BL21(DE3)，经诱导高效表达出HIV-1 gp120基因片段。结果间接酶联免疫吸附试验(ELISA)及Western blot实验表明，表达产物具有良好的抗原性及特异性。SDS-PAGE电泳分析结果表明，gp120表达量占总菌体蛋白的50%。结论在原核系统中高效表达了HIV-1gp120基因。

High-level expression of human immunodeficiency virus type 1 gp120 protein in E.coliBi lan,Lei Xiaojun,Zhu Jiahong,et al.Wuhan Institute of Biological Products,The Ministry of health,Wuhan 430060

AbstractIn order to improve protein expression and to produce good and cheap diagnostic antigen,the gene fragment (560bp)in N-terminal of gp120 of HIV-1 lAV strain was amplified by PCR.After digested by EcoRⅠ and SalⅠ,the fragment was cloned into a high-level expression vector pET28a.The recombinant plasmid pET/120 transfecting BL21(DE3)produced the protein with high-level expression in the host cell bL21(DE3),which was further proved having good antigenicity and high specificity by indirect ELISA and Western-blot assay.The proteiu expressed was about 50% of the total bacterial protein by SDS-PAGE electrophoresis test.It was highly expressed in the prokaryotic expression system.

Key words：Human immunodeficiency virus type 1gp120VectorGene expression

我国目前已有数十万人感染艾滋病毒，急需大量优质抗原用于病人和血源检测。HIV-1的包膜糖蛋白(env)基因编码gp160蛋白，进一步加工成gp120及gp41^［1］，具有较强的抗原性，能使人体产生抗体并具有持久性，其抗体阳性被视为诊断HIV感染的重要指标^［2］。为了提高HIV-1gp120基因的表达量，我们以质粒pMN2.7为模板，扩增出560bp的HIV-1 lAV株gp120N端基因片段，并克隆原核表达载体pET28a中，建立了高效表达HIV-1 gp120基因的重组质粒pET/120。

1材料和方法

1.1质粒和菌株质粒pMN2.7由德国Paul-Ehrlich研究所K.Chichuted教授惠赠，含有HIV-1LAV株env全基因。pET28a由武汉生物制品研究所基因工程室保存，为T7启动子控制下的融合表达载体，使外源蛋白N端与6个连续的组氨酸残基(His6)融合的形式表达^［3］。菌株BL21(DE3)为该载体的表达宿主菌。

1.2其他试剂gp120 McAb由解放军农牧大学金宁一教授惠赠。

1.3gp120基因片段的扩增参照文献［4］设计引物，并用计算机软件OLIGO进行合理性评估。引物序列Ⅰ：5'-GCTTCGAATTCTTGATGATCTGTAGTGCT-3';序列Ⅱ：5’TACGCGTCGACATTGGCTCAA3’。在5’端导入EcoRⅠ酶切位点，3’导入SalⅠ酶切位点，以质粒pMN2.7为模板，扩增系统：10×PCR缓冲液，0.2mmol/L d NTP,100ng模板DNA，总体积100μl，扩增条件为94℃45秒，55℃30秒，72℃ 1分30秒，共30个循环。最后72℃延伸10分钟。

1.4重组蛋白的表达和鉴定将含重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)接种于含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡过夜，次日将活化菌经1%的比例重新接种于新的培养液中，于37℃继续培养振荡，待其吸光度A值(曾称光密度OD值)(600nm)达0.5～2时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养5小时，留样进行SDS-PAGE及Western blot。 离心收集表达菌体，经超声破碎，离心收集沉淀。用含0.5% triton X-100的50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA溶液洗涤2～3次，10?000r/min离心取沉淀，将沉淀溶于含8mol/L尿素的50mmol/L tris-HCl(pH8.0)、2mmol/L EDTA、10mmol/L DTT溶解。将此抗原以1:1?000稀释后包被酶标板。

1.5重组蛋白的检测用间接ELISA法及Western blot法检测重组的gp120，第一抗体为抗gp120的单克隆抗体(McAb)，第二抗体为酶标抗鼠IgG mcAb。

2结果

2.1重组质粒的构建和鉴定PCR扩增片段长为560bp，与预计的大小相符。将PCR产物以EcoRⅠ及SalⅠ酶切后插入pET28a的相同

图1HIV-1 gp120基因表达质粒的构建

Fig.1Construction of plasmid pET/120 expressing the gp120 gene of hIV-1

位点，并使融合蛋白的读码框与原毒株一致，得到含gp120基因的重组表达载体pET/120，克隆策略见图1。重组质粒经EcoRⅠ及SalⅠ酶切鉴定，得到560bp及5.2kb的两条片段，与预期结果相同(图2)。

2.2重组蛋白的表达及鉴定SDS-PAGE显示pET/120的菌体在约24kD处呈现一较浓染色的蛋白条带。只含pET28a空载体质粒的菌体则无此带(图3)，光密度扫描显示，目的蛋白表达量占细菌蛋白总量的50%。间接ELISA表明，HIV-1 gp120 McAb与pET/120表达产物呈强阳性反应，而与pET载体的细菌产物则无反应。Western blot显示，在24kD处出现一条反应带(图4)。

图2重组质粒的酶切鉴定

Fig.2Restriction map of recombinant plasmid

1：PCR amplification fragment from pMN2.7;2:pET/EcoRⅠ+SalⅠ；3：pET/120/EcoRⅠ+SalⅠ；4：λDNA/HindⅢ

图3菌体蛋白的SDS-PAGE结果

1：标准分子量蛋白质；2：pET/120转化BL21(DE3)菌；3：pET转化BL21(DE3)菌；4：pET/120转化BL21(DE3)菌(未经IPTG诱导)

Fig.310%SDS-PAGE result of the expressed production of pET/120 in e.coli

1：Standard protein marker;2:E.coli BL21(DE3)transfected with pET/120；3：BL21(DE3) transfected with pET；4：BL21(DE3)transfected with pET/120(uminduced with IPTG)

图4重组蛋白的Western blot分析

注同图3

Fig.4Western-blot analysis of recombinant protein expressed by pET/120

Notes as Fig. 3

3讨论

用基因工程技术在大肠杆菌系统中表达HIV抗原，具有成体低，产量高，易操作等优点。但原核表达载体随着外源基因的增大，其表达产量降低。我们曾在原核中表达了HIV-1 gp160基因2.1kb片段，但表达量很低，且蛋白有降解现象^［5］，其他文献也有类似报道^［1］。我们借助Prosis软件对蛋白进行亲水性分析，推测gp120N端抗原位点较多，因此将HIV-1 gp120基因由3’至5’切短到560bp，并将其克隆进pET28a载体中，在大肠杆菌中，高效表达了HIV-1 gp120基因，其表达量越占细菌总蛋白的50%，且表达的蛋白很稳定，没有被降解。间接ELISA及Western blot证实，表达产物具有良好的抗原性及特异性。另外，目的蛋白以N端与6个连续的组氨酸残基(His6)融合的形式表达，表达产物可经金属离子(Ni2+)配体亲和层析而进一步纯化^［4］。这些均为制备大量及高纯度的HIV-1诊断抗原打下了良好的基础。有关该表达产物的纯化及用作诊断抗原的研究正在进行中。

参考文献

1王文斌，邵一鸣，曾毅，等.HIV-I SF株env基因(120)在大肠杆菌中的表达.病毒学报，1996，12(1)：18-22.

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3陈长征，黄华，龚健，等. 大肠杆菌His6融合表达载体及其表达产物的进一步纯化.生物化学与生物物理学报，1996，28(5)：523-529.

4Mark A M,Douglas H S,Cirilo D,et al.Nucleic acid structure and expression of the human aIDS/lymphadenopathy retrovirus.Nature,1985,313(7):450-458.

5闭兰，张为，吴雷，等.人类免疫缺陷病毒l型包膜糖蛋白基因(HIV-l env gp160)在大肠杆菌中的表达.第四次全国生物制品学术会议论文汇编.武汉：武汉生物制品研究所，1997，5月10日，123页.