关键词: 噬菌体；促红细胞生成素；重组抗体

【摘要】目的获得抗重组人红细胞生成素(rhEPO)的单链抗体(ScFv)，为得到纯度高、活力强的重组人红细胞生成素(rhEPO)产品和制备红细胞生成素(EPO)检测试剂盒奠定基础。方法采用噬菌体表面表达和重组抗体技术，从已建立的鼠抗rhEPO杂交瘤细胞株D3中克隆出抗rhEPO单链抗体ScFv基因片段，经噬菌体表面呈现，与固相抗原rhEPO结合，“吸附—洗脱—富集”，酶联免疫吸附法(ELISA)检测，酶切鉴定及PCR扩增鉴定，将阳性克隆重组质粒转化非抑制型E.coli HB2151,诱导表达抗rhEPO单链抗体，Western blot和Dot-blot杂交检测其抗原特异性。最后对阳性克隆进行序列测定，进行序列分析。结果挑选出了噬菌体表面表达抗rhEPO单链抗体的阳性克隆，可溶性表达的单链抗体主要分布于细菌培养上清中，并且保留了亲本单抗对rhEPO的抗原特异性和免疫活性。表达产物分子量约为32kD左右。结论本实验成功地获得了抗rhEPO抗体的可变区VH、VL基因，并表达出单链抗体ScFv片段。

Generation of anti-rhEPO ScFv by using phage display technology

Zhong Lingwen, Wu Shuhua, Yang Xiang, et al. Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing100052

AbstractIn this paper, the recombinant phage antibody techniques was used to construct, clone, screen, and express anti-rhEPO single chain antibody ScFv. The variable region genes of antibody were amplified by PCR from a hybridoma cell line D3 which secreted monoclonal antibody to rhEPO. The ScFv gene fragments were successfully cloned into phagemid vector pCANTAB5E. The recombinant phages were panned by rhEPO which was coated on a microtiter plate. After three rounds of panning, 8 clones were determined specifically binding to rhEPO antigen. The positive recombinant phagemids were extracted and transformed into non-suppressed E.coli HB2151. The soluble single chain antibody was expressed, and the specificity of the expressed ScFv was determined by ELISA, Western blot and Dot-blot. The result of SDS-PAGE indicated that the apparent molecular weight of the target peptide which is mainly in culture supernatant is 32kD. The DNA sequence data showed that the ScFv gene included 783bp, encoding 261 amino acids.

Key words：PhageHuman erythropoietinRecombinant antibody

人类促红细胞生成素(Human erythropoietin, huEPO)作用于骨髓红系造血前体细胞，维持其存活，促进其增殖分化，防止晚期红系祖细胞的程序化死亡(Apoptosis)^〔1〕。目前EPO作为一种治疗贫血的多肽药物，已取得了良好的临床效果。

噬菌体表面表达技术(Phage display technology, PDT)是一项利用丝状噬菌体体外表达外源基因的新型技术^〔2〕。现在所构建的噬菌体载体多利用在pⅢ蛋白基因区引入外源基因，以融合蛋白的形式表达出来，并随着噬菌体的组装而呈现在其表面，并使表达产物保持良好的空间构象^〔3〕。噬菌体表面表达技术已成为抗体工程的一项重要技术，它模仿人体内抗体的形成过程，将抗体片段呈现在噬菌体表面，建成噬菌体抗体库，用与亲和层析相类似的原理，从抗体库中筛选出特异性噬菌体抗体。通过体外亲和力成熟技术诱变，使噬菌体抗体获得更高的亲和力，再将其转染其他宿主菌或将抗体基因克隆入表达载体来实现可溶性表达，获得高亲和力的基因工程抗体^〔4〕。本实验采用噬菌体表面表达技术，从鼠抗rhEPO杂交瘤细胞株D3中，用反转录PCR法获得重链、轻链可变区基因，构建、克隆、筛选、表达出单链抗体ScFv-D3，为EPO的进一步纯化及制备EPO检测试剂盒提供条件，并为EPO结构及功能的研究奠定基础。

1材料和方法

1.1细胞株和菌株分泌抗rhEPO单克隆抗体的杂交瘤细胞株D3由病毒学研究所制剂室提供。宿主菌E.coli TG1的基因型为supE, hsd, △5, thi △(lac-proAB)，△(srl-recA)306：Tn10(tet¹)F′［proAB+lacIq，lacZ △ M15］，E.coli HB2151的基因型为K12 △(lac-pro)，ara,nalr,thi F′［proAB, lacIq, lacZ (M15］均购自瑞典Pharmacia公司。E.coli JM109基因型为recA1,supE44,endA1,hsdR17,gyrA96,relA1,thi △(lac-proAB)，F'［traD36proAB+lacIqlacZ △ M15］由基因工程国家重点实验室保存。

1.2主要试剂盒重组噬菌体抗体系统(Recombinant phage antibody system)购自瑞典Pharmacia公司。mRNA分离纯化系统(mRNA isolation system)，购自美国BRL公司。pGEM-T载体系统(pGEM-T vector system)，购自美国Promega公司。

1.3主要试剂与酶限制性内切酶及各种修饰酶分别购自美国Promega公司，New England Biolabs公司，德国Boehringer Mannheim公司，瑞典Pharmarcia公司，中国协和医科大学科学技术开发公司。酶标羊抗鼠IgG抗体、酶标羊抗兔IgG抗体和IPTG均购自北京北方同正生物技术发展公司。兔抗F1噬菌体抗体由病毒学研究所李爱民博士惠赠。dNTP购自德国Boehringer Mannhageim公司。

1.4PCR鉴定用引物重链可变区(VH)5’端引物：5’-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC-3’(S1)，3’端引物：5’-CCAGAGCCACCTCCGCCTGAACC-3’(S4)；轻链可变区(VL)5’端引物：5’-GGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGG-3’(S3)，3’端引物：5’-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3’(S6)。

1.5建立噬菌体抗体库D3杂交瘤细胞株总RNA按异硫氰酸胍/酸酚一步提取法；D3单抗ScFv基因片段的克隆及重组噬菌体抗体库的建立按Recombinant Phage Antibody System Kit提供的方法进行。

1.6抗rhEPO噬菌体抗体的亲和吸附及富集

1.6.1浓缩重组噬菌体抗体库取噬菌体抗体库的上清液4ml加入0.8ml 20%PEG8000，2.5mol/L NaCl，混匀，冰浴40min，4℃ 10 000r/min离心20min，弃去上清，沉淀悬于1%BSA溶液中，4℃15 000r/min离心5min，取上清，即为浓缩的待筛选的重组噬菌体抗体库溶液。

1.6.2包被20μg/ml抗原100μl每孔，4℃过夜。

1.6.3封闭3%BSA溶液150μl每孔，37℃1小时。

1.6.4孵育每孔加100μl浓缩的噬菌体抗体库溶液，30℃2小时。

1.6.5洗脱用无菌的含0.5%Tween-20的PBS溶液(PBS-洗脱T)洗孔2次。每孔加100μl 0.1mol/L盐酸-甘氨酸(HCl-Gly)溶液(pH2.2)，室温静置10min，收集洗脱液，加入3%体积的12mol/L Tris中和。

1.6.6转染将洗脱液加入到1ml新鲜培养的A值为1.0的TG1菌液中。37℃15min后，取1μl用于测定菌落形成单位(CFU)，其余菌液37℃振荡培养1小时。

1.6.7重组噬菌体的释放取0.5ml 1.6.6的菌液加入3.5ml含0.1%氨苄青霉素，2%葡萄糖的2×YT培养液(YTAG)中，37℃培养至A值约0.5，加入5×10⁹ PFU辅助噬菌体M13KO7，37℃振荡培养1小时，5000r/min离心10min, 用4ml含0.1%氨苄青霉素，0.5%

卡那霉素的2×YT培养液(YTAK)悬起沉淀，37℃振荡培养15～17小时。按1.6.1浓缩培养上清，得到第一轮富集后的噬菌体抗体，可重复1.6.2～1.6.7步2～3次。

1.7抗rhEPO噬菌体抗体阳性克隆的挑选及重组噬菌体质粒的鉴定采用ELISA法^〔5〕挑选阳性克隆，用双酶切法^〔6〕，PCR扩增法鉴定重组噬菌粒。

1.8单链抗体ScFv-rhEPO的可溶性表达将重组质粒转化至HB2151菌中，1mmol/L IPTG30℃诱导表达20小时。10 000r/min离心，收集上清，沉淀用PBS悬起，在液氮和37℃水浴中反复冻融3次，离心收集上清，为细菌质周腔提取液。

1.9表达产物及特异性鉴定SDS-PAGE电泳，Wester blot法^〔13〕；ELISA法及Dot blot法^〔6〕。

1.10抗rhEPO单链抗体ScFv的基因测定及序列分析按pGEM-T Vector System Kit说明将VH和VL基因片段克隆至测序载体pGEM-T上，序列由中国军事医学科学院生物工程研究所DNA合成及测序分析室测定。

2结果

2.1RT-PCR法扩增单链抗体ScFv基因及其组装用重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)引物做RT-PCR扩增VH和VL基因片段，1.5%琼脂糖凝胶电泳，可以清楚地看到350bp处有DNA条带(图1，图2)，即为扩增的VH与VL DNA片段。PCR法将VH和VL片段Linker连接起来，从1.2%琼脂糖凝胶电泳可知ScFv(即VH-Linker-VL)DNA片段长度约750bp(图2)。将此DNA片段克隆入噬菌体载体pCANTAB5E，加入辅助噬菌体感染后构成噬菌体抗体库。

图1VH和VL基因的PCR扩增产物