关键词: 合成肽；表皮生长因子；受体介导；基因转移

【摘要】目的发展一种针对表皮生长因子过量表达的肿瘤细胞的基因转移系统。方法人工合成了一种N端含多个赖氨酸残基，C端为人表皮生长因子(EGF)的受体结合域的33肽，此合成肽(K9E肽)既具有DNA结合活性，又能为细胞表面EGF受体所识别并内在化。K9E肽与萤火虫荧光素酶表达质粒pEBluc按一定比例结合形成核酸复合物，以此为基础，利用受体介导的基因转移技术，组建了外源基因转移系统。结果核酸复合物直接加入于类上皮癌细胞A431的培养液中，48小时后可从细胞裂解液中测出荧光素酶的显著表达。结论该系统可特异性地将外源 基因导入EGF受体过量表达的肿瘤细胞。

A novel gene delivery system targeting to epidermal growth factor receptor overexpressing cancer cells

Gong Huiyu, Wu Xiaobing, Shu Yuelong, et al. National Laboratory of Molecular Virology and Genetic Engineering, Beijing100052

AbstractA polypeptide with 33 amino acid residues was designed and synthesized. Its C terminal was composed of multiple lysine residues, which played as a DNA condensing agent, whereas the N terminal was the receptor binding domain of Epidermal Growth Factor(N₃₂～K₄₈). Through a spontaneous self-assembly process with electrostatic interaction, the synthetic peptide combined with a luciferase expression vector, pEBluc, to form an EGF receptor targeting nucleic acid complex. Significant luciferase activity was detected 48 hours after adding this complex directly to the culture medium of the A431 cells. This synthetic peptide could be used to construct a gene transfer system mediated by the endocytosis via EGF receptor. It promoted a very possibility of the gene therapy for the cancers such as glioma, melanoma and squamous carcinoma which are known of epidermal growth factor receptor overexpresssion.

Key words:Synthetic peptideEpidermal growth factorReceptor mediatedGene transfer

发展适当的非病毒方法，特别是利用细胞表面受体介导的基因转移技术将外源基因特异性导向靶细胞表达是近年来基因治疗研究的热点之一。与常规的病毒载体相比，它是一种安全、特异并可实现直接体内定向转移基因的方法，具有很大的应用可行性^〔1〕。一些恶性肿瘤如神经胶质瘤、黑色素瘤、磷癌等，其癌细胞表面的表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)受体的数量大大高于正常细胞，肿瘤细胞上EGF受体的过量表达为定向转移治疗基因提供了“靶子”，针对EGF受体的单抗与多聚赖氨酸的偶联物^〔2〕或重组EGF与多聚赖氨酸的偶联物^〔3〕均能与DNA分子通过电性结合形成一种能为EGF受体识别并内在化的核酸复合物，将外源基因导入EGF受体过量表达的肿瘤细胞中表达。本文报道作者合成的一种含人EGF分子中受体结合域(C环，N32-K48)的新型EGF受体导向的DNA结合分子及以之为基础构建的肿瘤细胞导向基因转移系统。

1材料和方法

1.1EGF受体导向的DNA结合分子的合成及纯化用ABI431A多肽合成仪按Fmoc化学方法合成该肽。合成肽(K9E)的序列为：NH_〔2〕-YKAKKKKKKKKWR-GGG-NCYIGERCQYRDLK-COOH。合成肽脱保护并将其从固相载体上裂解下来的反应体系为：0.75g结晶酚，0.25ml二巯基乙二醇，0.5ml苯甲硫醚， 0.5ml水，10ml三氟乙酸，搅拌下反应3小时，反应物过滤得到的清液以乙醚反复抽提后冻干得到合成肽粗品。粗品溶于水后经Sephardex G25凝胶过滤，收集的第一个A(280nm)吸收峰加入K₃Fe(CN)₆至5mmol/L，室温过夜以使巯基氧化形成二硫键。然后加入TFA至终浓度0.1%，在Waters 600HEPL系统以Delta Pac C8柱(A液：0.1%TFA；B液：10%TFA，10%乙腈，线性梯度；流速2ml/min)分离，收集梯度为45%～55%B液时的洗脱峰。洗脱液通过旋转蒸发浓缩并除去乙腈及TFA，用水调浓度至280nm时的吸光度A＝1。

1.2质粒与细胞pEBLuc^〔4〕为病毒基因工程国家重点实验室构建的含萤火虫荧光素酶的真核细胞表达质粒，质粒按常规碱裂解法制备。人类上皮癌细胞系A431^〔5〕传自医科院肿瘤医院，培养条件均为RPMI1640加10%胎牛血清，37℃培养及传代。

1.3DNA结合试验20μl150mml/L NaCl水溶液，含有1～8μl不等的肽K9E肽(A＝1)和固定量(1μl) pEBluc质粒，室温放置2小时后，用0.7%琼脂糖凝胶电泳，观察DNA的迁移率变化。

1.4DNA复合物的形成和培养细胞的转染细胞在转染前一天传于6孔细胞培养板(35mm直径)，每孔约50万细胞，37℃ 5%CO₂培养，转染前细胞约50%成片。脂质体介导的转染采用lipofectamine试剂进行；受体介导的转染将10μg质粒DNA与40μlK9E肽(A＝1)混合于200μl 150 mmol/L NaCl溶液，室温放置2小时，然后与0.8 ml含12.5%

灭活胎牛血清的细胞培养液混合，直接加之于待转染细胞。24小时后换新鲜培养液继续培养。

1.5报道分子及其测定细胞转染pEBLuc?48小时后，采用Promega公司的荧光素酶检测系统，在Beckman LS-5000液体闪烁计数仪利用单光子计数程序测定细胞裂解液的荧光素酶活性，样品中所含荧光素酶以反应系统加入待测样品后1分钟内释放的光子数(cpm)来评价^〔6〕。

2结果

2.1EGF受体导向的DNA结合分子(K9E肽)通过自动化固相合成的K9E肽分离提纯后，经ABI 477A自动化多肽/蛋白测序仪分析其N端确证所得产物与设计分子一致。K9E肽全长33个氨基酸，分子的N端为含10个碱性氨基酸(9个赖氨酸、1个精氨酸)的YKA(K)₈WR的结构，C端为EGF的C环的N₃₂～K₄₈，分子中的两个半胱氨酸形成二硫键环化，此17个氨基酸构成了EGF的受体结合域的主要成分^〔7〕。分子的C端与N端通过中间的3个串联的甘氨酸相连。分子N端的多碱性氨基酸赋予K9E肽高密度的正电荷，使其能通过电性中和与DNA分子结合，图1的DNA凝胶阻滞试验表明浓度为A＝1时的K9E肽，每4μl能与1μgpEBluc质粒完全结合。

图1凝胶阻滞分析K9E肽与pEBluc的结合

1: 1μg pEBluconly；2～9：1μgpEBluc与不同量K9E肽结合，每泳道依次为1～8μl(A＝1)

fig. 1Gel band-shift assay of pEBluc binding with galatosylated histone

1: 1μg pEBluc. 2～9: 1μg pEBluc binding with 1～8μl galatosylated histone(with successive increasing by 1μl)

图2K9E/pEBLuc复合物转染A431细胞

1: 单独pEBluc；2：Poly-L-lysine/pEBluc复合物；3：K9E/pEBluc复合物；4：K9E/pEBluc复合物+100μmol/L氯喹；5：K9E/pEBlu复合物+HA2-polglysine6:脂质体介导转染pEBluc

fig. 2The transfection of the pEBluc complexed with different DNA carriers

1: pEBluc only. 2:poly-L-lysine/pEBluc complex. 3:K9E/pEBluc complex. 4: K9E/pEBluc complex in the condition of 100μmol/L Chloroquine.5:K9EB/pEBluc complex. in the condition of HA2-polylysine. 6:Transfected pEBluc with lipofectamine reagent

图3K9E/pEBluc复合物的量对转染效率的影响

fig. 3Effect of the dNA complex quantity on the transfection efficiency in HepG2 cells重组人EGF，比较4小时后换液培养的结果，可见所检出的荧光素酶活性明显下降，反映出重组EGF分子与核酸复合物竞争与其受体结合，但24小时后换液培养，加入EGF或不加EGF的转染，其结果没有明显差别，这可能与EGF受体-配体复合物内在化后受体的再循环有关。见图4。

图4EGF对K9E肽介导pEBluc转染效率的影响

1: 不加EGF(4小时后换液)；2：加EGF(4小时后换液)；3：(不加EGF(24小时后换液)；4：加EGF(24小时后换液)

fig. 4Effect on the K9E/pEBluc complex transfection to A431 cell line with adding 5 μg recombinant EGF

1: Without rEGF (changed the medium 4 h after transfection)；2: With rEGF (changed the medium 4h after transfection);3:Without rEGF (changed the medium 24 h after transfection);4: Wit