关键词: 巨细胞病毒；包涵体；小鼠模型；空斑形成单位

【摘要】目的为了探讨巨细胞病毒的致病机理。方法4周龄Balb/C小鼠腹腔内接种小鼠巨细胞病毒(MCMV)。结果导致小鼠急性感染期体重下降，生长迟缓，唾液腺肿胀以至于死亡。唾液腺中检出高滴度感染性病毒(2.0×10⁵PFU/ml)。在小鼠3T3/Swiss albino细胞单层上形成的空斑清晰，易判断计数 、镜检组织切片可见脑神经原细胞胞浆内包涵体。结论小鼠巨细胞病毒模型的建立为抗-CMV有效药物的筛选以及对CMV感染的预防、治疗提供了资料。

Primary studies on the establishment of cytomegalovirus murine model

Ji Yuhua,Zhu Yueqiu, Chen Shuyun, et al. Department of Clinical Laboratory,Rui Jin Hospital, Shanghai200025

AbstuactIntraperitoneal inoculation of Murine cytomegalovirus(MCMV) into Balb/C mice at age of 4 weeks resulted in acute MCMV infection of the mice. The infected mice had body weight reduction,growth retardation,salivary gland swelling and death.A lethal dose was 5×10⁶PFU/ml of MCMV.Virus could be recovered from salivery gland and the infectivity titer of MCMV reached to a high titer of 2×10⁵PFU/ml. Plaque formation of MCMV in 3T3/Swiss albino cells wasidentified. Histopathological examination showed the appearance of MCMV-specific intracytoplasmic inclusion bodies in neuron cells of the mouse brain.

Key words:CytomegalovirusInclusion bodyPlaque forming unitMice models

巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)在人群中感染广泛。目前已知CMV在健康人中潜伏感染的方式存在，一旦机体免疫功能减弱或缺陷时，则可引起严重感染，CMV其有严格的种特异性。用小鼠CMV感染模型探讨CMV致病机理、预防和治疗措施等日益受到国内外学者的关注^〔1～4〕。本文报告Balb/C小鼠急性CMV感染期的体重变化、唾液腺内病毒的含量以及组织病理变化结果。

1材料和方法

1.1病毒和细胞培养MCMV、Smith株由日本引进，本实验室传代细胞中传代适应^〔5〕。原代小鼠胚细胞的制备参见人胚肺细胞制备法。小鼠3T3/Swiss albino细胞株得自日本国立卫生试验所。

1.2动物和动物接种Balb/C小鼠4周龄，体重12～14g，雄性，购于上海市计划生育研究所纯种动物室(BK公司)。饲养在洁净层流柜^〔5〕。购入的实验动物，每5只为一组，称重后求均值记录。在购入后第3天时，腹腔内接种0.2ml不同浓度的病毒悬液(经小鼠体内传毒7～8次)，对照组接种非感染小鼠的唾液腺组织匀浆(1∶10)。所有动物在接种后不同期内称重，12～14天后在乙醚麻醉下放心血处死。无菌取唾液腺、脑等组织分组合并，称重、滴定病毒进行组织学检查。

1.3病毒滴定将无菌取得的部分唾液腺等组织用Hank's液漂洗净，用含2%小牛血清的Eagle's维持液研磨成10%的组织匀浆，离心后取上清在原代小鼠胚细胞或3T3/Swiss albino细胞单层的24孔/NunC细胞培养板上用空斑形成试验滴定病毒的含量，病毒的滴度用PFU表示。

1.4组织学检查将无菌取得的部分唾液腺等脏器组织，用10%甲醛缓冲液固定过夜。然后进行常规的石蜡切片和染色。

2结果

2.1动物体重及唾液腺等的一般变化4周龄Balb/C小鼠腹腔内接种MCMV(分别为1×10⁶，1×10⁵，1×10⁴ PFU)后出现竖毛、发育迟缓和体重减轻现象(图1)。其中接种MCMV1×10⁶PFU组在接种后第4天出现死亡小鼠，7天后仅有1只残存，而其它两组无死亡小鼠。比较动物唾液腺重/体重(SGW/BW)的比例，发现CMV感染组明显高于对照组。表明病毒感染期间有唾液腺肿大。

图1小鼠急性CMV感染期间体重的变化

fig. 1Changes of body weight of mice during acute CMV infection

图2急性CMV感染期小鼠唾液腺的病毒含量

fig. 2Virus infectivity titer in salivary gland of mice during acute CMV infection

2.2小鼠CMV感染后其唾液腺中病毒的含量小鼠腹腔内分别接种不同浓度MCMV，于2周后麻醉处死，从其唾液腺组织匀浆中检出病毒。MCMV在原代小鼠胚细胞或小鼠3T3/Swiss albino细胞单层上均出现明显的细胞病变效应(CPE)。用空斑形成试验滴定病毒量时，MCMV在小鼠3T3/Swiss albino细胞单层上形成的空斑，计数后结果为接种MCMV1×10⁶，1×10⁵和1×10⁴PFU三组中检出病毒量分别为1.2×10⁴，2×10⁴和2.4×10⁵PFU/ml，对照组动物的唾液腺中未能检出病毒，见图2。

2.3小鼠CMV感染后组织的病理变化对上述接种不同浓度MCMV的试验组中，随机分别各取出1只小鼠，麻醉后解剖，分别取唾液腺、心、肺、胸腺和脑组织作病理学检查。结果1只接种1×10⁵PFU小鼠的脑组织切片中找到胞浆内包涵体，经病理解剖判断为脑神经原细胞(图版IB)。而其它的所有组织切片仅显示有炎性细胞渗出或侵润并非典型。

3讨论

用小鼠CMV感染模型研究CMV，国外已有多篇报道，国内尚罕见。我们在建立的MCMV PCR产物探针等技术的基础上^〔5〕，进行了MCMV感染模型的建立和研究，发现了小鼠MCMV感染的致死剂量。4周龄的Balb/C小鼠腹腔内接种5×10⁶PFU/ml 0.2ml时，于接种后第4天始有死亡鼠，一般存活期不超过7天。为感染模型的应用奠定了基础。此后，我们在抗CMV有效药物筛选试验中，就以药物能否保护受致死剂量病毒攻击的动物不死或延长生存期为该药物是否有效的指标之一。图1所示，新生小鼠急性CMV感染期有一个明显的体重减轻期，且与感染的病毒量相关。此现象与文献^〔6〕结果相似。小鼠对MCMV感染的敏感性受MHC、年龄、干扰素和NK细胞等因素的影响^〔7，8〕。图1中可见虽经MCMV致死量1×10⁶PFU(5×10⁶PFU/ml)攻击后，个别小鼠度过一个低体重期后，出现了一个体重回升的趋势，同时也幸存下来。这种现象可能属小鼠个体间差异。

空斑测定是目前测定病毒感染性的比较准确的方法。与原代小鼠胚单层细胞培养物比较发现，MCMV在小鼠3T3/Swiss albino单层细胞培养物上形成的空斑更清晰，易判断计数(图3)。前者则细胞较杂、细胞繁殖率不一，形成的空斑难以准确计数。用空斑形成试验对感染小鼠唾液腺中病毒进行滴定，结果接种低剂量组(1×10⁴PFU)的小鼠唾液腺中排毒高达2.4×10⁵PFU/ml，而接种中、高剂量组却相对较低。1×10⁶PFU一般被认为是致死剂量，大剂量病毒同时进入宿主机体，由于病毒间的干扰或受染宿主细胞的急性大量死亡而导致病毒产量不高。而低接种剂量1×10⁴PFU(亚临床感染剂量)，在唾液腺中病毒产量较高。其它类似实验中也曾见病毒产量较高的现象(0.5～1.0×10⁵PFU/ml)。

1997年1月27日收稿11月11日修回

参考文献

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5季育华，朱月秋，陈淑云等. MCMV PCR产物探针的建立及初步应用，中华微生物学和免疫学杂志，1996，16(suppl-2):46-49.

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7Terese M Collins,Mary R Q，Mcolin J,Biphasic viremia and viral gene expression in leukocytes during acute cytomegalovirus infection of mice.J Virol,1994,68(10):6305-6311.