关键词: 抗体库；人源单克隆抗体；人免疫缺陷病毒

【摘要】目的构建人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)特异性噬菌体抗体库，制备人源抗HIV-1 gp120单克隆抗体。方法以半巢式聚合酶链反应(PCR)从HIV-1感染者外周血单个核淋巴细胞中扩增抗体重链Fd和轻链(k)基因，与噬菌体载体pComb3连接，构建噬菌体抗体Fab组合文库。对抗体库进行3轮吸附-洗脱-扩增的亲和选择后，以ELISA法筛选抗HIV-1 gp120噬菌体抗体，并进行DNA序列分析和Fab的可溶性表达。结果半巢式PCR有效地扩增出Fd和k基因，以此构建成容量为1.95×10⁷的噬菌体抗体库。3轮亲和选择使特异性抗体得到高度富集，抗HIV-1 gp120噬菌体抗体阳性克隆占32%。对一阳性克隆抗体基因CH1和CL部分DNA序列进行了测定，并在大肠杆菌表达出可溶性Fab。结论抗HIV-1特异性噬菌体抗体库的构建和人源抗HIV-1 gp120单克隆抗体的制备为今后筛选抗HIV中和抗体奠定了基础，具有重要的应用价值。

Construction and screening of type 1 human immunodeficiency virus specific phage antibodies combinatorial library

He Yuxian, Wang Xue, Liu Shunai, et al. Research Center of Virology, Beijing Ditan Hospital, Beijing100011

AbstractHuman monoclonal antibodies to type 1 immunodeficiency virus (HIV-1) gp120 were generated from phage antibody combinatorial library. Methods: The human immunoglobulin heavy chain Fd and light chain k genes were amplified by half-nested PCR from PBMC of patient infected with HIV. Phage antibody combnatorial library was constructed with the Fd and k chain genes using Pcomb3 as vector. The affinity selection and ELISA were adopted for generating specific phage antibodies. Partial DNA of a positive clone was sequenced and its soluble Fab was expressed in E coli. HIV-1 specific phage antibodies combinatorial library were constructed using the Fd and k genes and Pcomb3 vector. The library capacity was about 1.95×10⁷. The specific phage antibodies were highly enriched after three rounds of biopanning selection against HIV-1 gp120 and 32% positive clones were detected by ELISA screening. DNA fragment coding for CH1 and CL derived from a positive clone was sequenced and its product was successfully expressed as soluble Fab which was specific for HIV-1 gp120. The HIV-1 specific phage antibody combinatorial library and human monoclonal antibodies to HIV-1gp120 have been used as tools for screening of neutralizing antibodg to HIV-1, and the methods seem to be very crucial and applicable.

Key words：Antibody libraryHuman monoclonal antibodyHuman immunodeficiency virus

人源单克隆抗体(单抗)具有广阔的临床应用前景。基因工程抗体的快速发展，为制备人源单抗提供了可靠的途径^〔1〕。尤其是新近建立的噬菌体抗体库技术^〔2，3〕，直接利用人抗体基因构建含有VH和VL的组合文库，以噬菌体表面显示系统筛选抗原特异性人源抗体。它以细菌克隆取代了B细胞克隆，被誉为抗体技术的革命性进展。我们利用该技术从一HIV-1感染者外周血单个核淋巴细胞(PBMC)分离抗体基因，构建了噬菌体抗体组合文库，并从中筛选到多株针对人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)外膜蛋白gp120的人源单抗。

1材料和方法

1.1质粒，菌株和主要试剂表达载体pComb3购于美国Scripps研究所，大肠杆菌株XL1-Blue及辅助噬菌体VCSM13购于美国Stratagene公司，测序载体pBlue Script和大肠杆菌DH5a购于北京华美公司；限制性内切酶，T4 DNA连接酶和Taq DNA聚合酶为Promega产品；mRNA提取和cDNA合成试剂盒为Invitrogen产品；DNA测序试剂盒购自美国Life Science公司，³⁵S-dATP购自美国DUPON公司；SB和SOC培养液按常规方法自配。

1.2标本制备，mRNA提取和cDNA的合成HIV-1感染者经酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot确认抗HIV抗体阳性，抽取30ml外周静脉血肝素抗凝，以淋巴细胞分离液(中国医学科学院血液学研究所产品)分离PBMC，然后按试剂盒说明进行mRNA的提取和cDNA的合成。

1.3引物设计和半巢式PCR扩增参考文献^〔3，4〕设计重链Fd和k轻链引物，序列如下：Fd 5’外引物：5’-ATGGACTGGACCTGGAGG(A/G)TC(C/T)TCT(G/T)C-3’(P1)；5’-ATGGAG(C/T)TTGGGCTGA(C/G)CTGG(C/G)TTT(C/T)T-3’(P2)；5’-ATG(A/G)A(A/C)(A/C)(A/T)ACT(G/T)TG(G/T)(A/T)(C/G)C(A/T)(C/T)(C/G)CT(C/T)CTG-3’(P3)；Fd 5’内引物：5’-CAGGTGCAGCTCGAGCAGTCTGGG-3’(P4)；5’-GAGGTGCAGCTCGAGGAGTCTGGG-3’(P5)；5’-CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGGG-3’(P6)；5’-GAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGGG-3’(P7)。Fd 3’引物：5’-GCATGTACTAGTTTTGTCCCAAGATTTTGGG-3’(P8)。k 5’外引物：5’-ATGGACATG(A/G)(A/G)(A/G)(A/G/T)(C/T)CC(A/C/T)(A/C/G)G(C/T)(G/T)CA(C/G)CTT-3’(P9)。k 5’内引物：5’-GACATCGAGCTGACCCAGTCTGGA-3’(P10)；5’-GAAATTGAGCTCACGCAGTCTCCA-3’(P11)；5’-GATATTGAGCTCACTCAGTCTCCA-3’(P12)。k 3’引物：5’-GCGCCGTCTAGAACTAACACTCTCCTCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGATCTCAG-3’(P13)。扩增Fd先分别以P1，P2，P3三个5’端信号肽简并引物与3’端引物P8进行第1轮PCR，条件为94℃，60秒；48℃，60秒；72℃，90秒；25个循环。再以第一轮PCR产物为模板，分别以5’端内引物P4，P5，P6，P7与P8进行第2轮PCR扩增，条件为94℃，60秒；55℃，60秒；72℃，90秒；35个循环。k的扩增条件同Fd。

1.4细菌的电穿孔转化将5ml过夜培养的XL1-Blue菌液接种在500ml含有四环素10μg/ml的SB培养基中，37℃培养至吸光度A值(600nm)约0.8，冰浴15分钟，4℃离心弃上清，以10%冷甘油将细菌洗涤2次，然后悬浮于2ml10%甘油中即为感受态细胞，每管分装0.3ml于-70℃冻存。按Bio-Rad基因脉冲仪说明书所述方法进行电穿孔转化。

1.5抗体库的构建将重链PCR产物用Xho Ⅰ/Spe Ⅰ双酶切并纯化，用T4 DNA连接酶使之与相应酶切纯化的噬菌粒pComb3连接，然后电穿孔转化大肠杆菌XL1-Blue，于37℃振荡培养扩增转化后的细菌，提取含重链片段的pComb3进行Sac Ⅰ/Xba Ⅰ双酶切，并与用相应酶切纯化的轻链PCR产物连接，然后电转化XL1-Blue，迅速加入3ml SOC，于37℃振荡培养1小时后转移至100ml SB(含羧苄青霉素60μg/ml，四环素10μg/ml)中，37℃培养2小时，加入约10¹²CFU的辅助噬菌体VCSM13，37℃培养1小时，加入终浓度至70μg/ml的卡那霉素后振荡培养过夜。第2天离心收集上清，加入PEG8000至4%和NaCl至3%后，冰浴30分钟，于4℃ 16000r/min离心后弃上清，用2ml含1%BSA的PBS溶解沉淀，再以12 000r/min离心3分钟弃去不溶物，收集上清即为噬菌体抗体库。

1.6抗体库的亲和选择以每孔1μg HIV-1 gp120抗原包被ELISA板条，3%BSA封闭，PBS-T洗后加入噬菌体抗体库50μl(约10¹²CFU)，37℃温育2小时，吸去噬菌体抗体液，以PBS-T洗染3次然后加入50μl洗脱液(0.1mol/L HCl，以甘氨酸调至pH2.2，并含0.1%BSA)，室温静置10分钟，将洗脱液稍加吹打后吸出，立即用3μl 2mol/L Tris中和，接着使之感染2ml XL1-Blue(A约为1.0)，于室温静置30分钟后，加入10ml SB(含羧苄青霉素20μg/ml，四环素10μg/ml)中。随后的抗性培养，VCSM13的加入，CFU的滴定，噬菌体的沉淀和收集如同步骤5所述。如此反复3次淘洗，使特异抗体高度富集。第2轮淘洗用PBS-T洗5次，第3轮淘洗用PBS-T洗10次。

1.7阳性克隆的筛选三轮淘洗后所洗脱的噬菌体，感染XL1-Blue后划平板，过夜培养后随机挑选细菌克隆，接种于2ml SB(含羧苄青霉素60μg/ml，四环素10μg/ml)中，37℃培养4小时，加入约10¹²CFU的VCSM13，然后37℃培养过夜。1000g离心10min，取上清25μl与等体积1%BSA混匀，加到已经HIV-1 gp120抗原包被和BSA封闭的ELISA板孔内，于37℃温育2小时，用PBS-T洗板3次后，加入辣根过氧化物酶(HPR)标记的兔抗噬菌体VCSM13抗体(本室制备)，于37℃反应1小时后以OPD显色。用VCSM13作为阴性对照。

1.8DNA序列分析挑选阳性克隆扩大培养并提取质粒，分别用Xho Ⅰ/Spe Ⅰ和Sac Ⅰ/Xba Ⅰ将重链和轻链基因切下，以琼脂糖凝胶电泳回收并经玻璃奶方法纯化，然后与相应酶切的pBlue-Scripts质粒载体连接，转化大肠杆菌DH5a，扩增培养并提取质粒。按测序试剂盒说明进行双链测序。

1.9可溶性Fab的表达用Spe Ⅰ/Nhe Ⅰ双酶切上述质粒，除去噬菌体gⅢ片段，以T4 DNA连接酶使之自身环化，得到可溶性Fab表达载体，将其转化到XL1-Blue中，挑取单个菌落接种于含有羧苄青霉素的SB中，37℃培养至A(600nm)值约为0.6，加入IPTG至终浓度1mmol/L，于30℃振荡培养过夜，离心后分别收集细菌沉淀和培养液。将细菌沉淀用PBS悬起，加PMSF至终浓度34μg/ml，超声破碎，离心取上清。

1.10可溶性Fab的检测和鉴定采用ELISA方法测定上清和培养液中可<