关键词: 逆转录病毒；人乳头瘤病毒；反义RNA；子宫颈肿瘤

【摘要】目的研究癌基因的特异性反义RNA对癌细胞生长繁殖和恶性程度的影响。方法用逆转录病毒载体将人乳头瘤病毒(HPV)-16 E6E7反义RNA导入HPV-16 DNA阳性的宫颈癌细胞株CaSki中，观察该细胞在导入反义RNA后其表型特征和在裸鼠体内致癌能力的变化。结果HPV-16 E6E7反义RNA能降低宫颈癌细胞CaSki的生长速率，抑制其在软琼脂上的集落形成能力，并能明显地抑制其在裸鼠体内的致癌能力。Western blot分析发现HPV-16 E6E7反义RNA能使宫颈癌细胞中病毒HPV-16 E6基因的表达水平降低。结论HPV-16 E6E7反义RNA能使宫颈癌细胞CaSki恶性表型逆转；由其引起的癌细胞中HPV-16癌基因表达水平的降低可能是癌细胞表型逆转的原因之所在；HPV-16癌基因的表达水平对维持癌细胞的恶性表型起着重要作用。

The inhibitory effect of antisense-RNA of papillomavirus type 16 E6E7 genes on malignant phenotypes of cervical carcinoma cell line

Ming Lihua, Zhou Lanping, Shang Ming, et al. Cancer Institute, Chinese Academy Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing100021

Abstract In our previous study,the malignant phenotypes of the NIH3T3 cells, transformed with HPV-16 E6E7 genes, could be inhibited by the antisense RNA of HPV-16 E6E7. In this study, the antisense RNA of HPV-16 E6E7 was induced into the cervical carcinoma cells, caski, which contained HPV-16 DNA, The results showed that the cellular growth velocity was down regulated by the antisense RNA of HPV-16 E6E7, the ability of forming cellular colonies in soft agar medium and the tumorigenicity in nude mice of CaSki cells were also inhibited by the antisense cellular colonies in soft agar mediam and the tumorigenicity in nude mice of Caski cells were also inhibited by the antisense RNA. In addition, the decrease of the expression of viral early genes in carcinoma cells was detected with Western blot assay.It denoted that the phenotypes and the carcinogenicity of tumor cells were inhibited by the associated antisense RNA,and this may be one of the pathways inducing tumor cells reversion.

Key words:RetrovirusHuman papillomavirusAntisense RNACervical carcinoma

近十几年来的研究发现，与宫颈癌关系最为密切的病原体是人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)，约90%的宫颈癌组织和宫颈癌细胞系中可以检测到HPV DNA，尤以HPV-16型最常见。在多数阳性标本中HPV DNA都整合到细胞染色体DNA上，并且病毒的早期基因E6E7持续表达^〔1，2〕。体外实验表明，HPV E6E7能使人上皮细胞如宫颈上皮、阴茎包皮、乳腺上皮等细胞永生化^〔3〕。在宫颈癌细胞株和HPV转化的细胞中，当E6E7的表达降低时，细胞的表型特征均有向正常细胞表型逆转的趋势；不同宫颈癌细胞系的有丝分裂活性与E6E7基因的表达水平密切相关^〔4～6〕，由此可见HPV早期基因E6E7的表达在细胞癌变进程和维持癌细胞恶性表型方面起着重要作用。我们将HPV-16 E6E7 ORF的反义基因导入HPV16 DNA阳性的宫颈癌细胞中，研究反义RNA对癌细胞的增殖和致癌性等方面的影响，并探讨反义RNA使宫颈癌细胞表型逆转的分子机理。

1材料和方法

1.1材料来源宫颈癌细胞株CaSki由中国医学科学院基础医学研究所李昆教授赠送。Balb/nu/nu裸鼠4～6周龄，雌性，由中国医学科学院肿瘤研究所动物室提供。抗HPV-16 E6蛋白单抗的研制见文献〔7〕。

1.2假型逆转录病毒的构建从E6的第一个起始密码子到E7的终止密码子的一段序列经PCR扩增，BamH?I消化，反向插入PZipneoSV(X)1 BamH?Ⅰ位点构成重组质粒，用脂质体将该重组质粒导入病毒包装细胞PA317中，经G418筛选获得具有感染活性的假型逆转录病毒PA19^〔4〕。PCR扩增反应所用的上游引物为5’-GAGGATCCATGCACCAAAAG-3’，下游引物为5’-GTATTAGATGGTACCTAGGAG-3’。

1.3细胞的病毒感染与筛选宫颈癌细胞株CaSki细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中培养，细胞长到70%～80%汇合时，倒掉培养液，用PBS(pH7.4)洗2次，加入1ml PA19病毒悬液，37℃静置吸附1小时，再加入培养液于37℃5% CO₂条件下培养。待细胞长成单层后，按1：5比例传代，将细胞置于含300μg/ml G418、10%胎牛血清的DMEM选择培养液中培养，每2～3天换1次培养液，选择1个月后换正常培养液，继续培养2周左右，可见有细胞集落形成，挑选单个细胞集落扩大培养，将该细胞称作CaSki-As。

1.4细胞生长曲线的测定将对数生长期的细胞用PBS洗2次，0.25%的胰酶消化后，离心去除胰酶，加入培养液制成10 000细胞/ml的细胞悬液，接种到6孔培养板，每孔接种2ml，于37℃5%CO₂孵箱中培养。从次日起，每天取3孔细胞，0.25%的胰酶消化后，加入细胞培养液吹打分散，制成细胞悬液，计数每孔内的细胞数，取3孔细胞数的平均数，共进行3次实验，取3次所测细胞数的平均值，以细胞培养天数对每瓶内的细胞数绘制细胞生长曲线。

1.5细胞软琼脂培养用含10%FBS的DMEM培养液制成的0.6%和0.35%的双层琼脂作细胞软琼脂培养，每个直径60mm的培养皿中接种1.5×10⁴个细胞，于37℃5%的CO₂孵箱中培养2～3周。每种细胞在每次实验中接种3块平皿，共进行3次实验。计数细胞集落，取其平均值，

1.6致瘤性检测将对数生长期的细胞收集起来，调整细胞浓度至1×10⁸细胞/ml，接种于裸鼠身体两侧，每侧接种细胞悬液0.1ml，左侧接种CaSki细胞，右侧接种CaSki-As细胞，共接种5只裸鼠。

1.7细胞中反义RNA基因的Southern blot分析细胞染色体DNA用蛋白酶K消化的方法提取后，取1μgDNA，BamH?I消化过夜，0.7%琼脂糖凝胶电泳分离后转移到尼龙膜上，与地高辛标记的HPV-16 DNA探针杂交。

1.8细胞内蛋白表达的Western Blot分析单层细胞经冷PBS冼2次，收集到缓冲液(50mmol/L Tris.Cl,pH6.8,10mmol/L DTT,2%SDS,0.1% 溴酚蓝，10%甘油)中，沸水浴10分钟，使样品反复通过4号针头以降低粘度，10 000rmin离心10分钟，取上清，经15%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至尼龙膜上，用E6蛋白单克隆抗体和兔抗鼠IgG辣根过氧化物酶二抗进行免疫酶反应，检测细胞中E6蛋白表达情况。

2结果

2.1反义RNA对癌细胞生长特性和致癌能力的影响用假型逆转录病毒将HPV-16 E6E7反义RNA导入宫颈癌细胞株CaSki-s细胞中，经G418筛选，获得含HPV-16 E6E7反义RNA的CaSki-As细胞。从细胞生长曲线图上可看到CaSki-As细胞的生长速率明显比CaSki细胞慢。在软琼脂培养中，CaSki-As细胞的集落形成率比CaSki细胞明显降减少。由此可见，HPV-16 E6E7反义RNA可使含有HPV-16基因的癌细胞CaSki的生长速率和集落形成能力明显降低。将CaSki-As细胞接种到裸鼠身体右侧，同时将CaSki细胞接种到裸鼠左侧，每点接种细胞量约1×10⁷，经过约2周，在接种CaSki细胞的部位能摸到有肿块形成，第3周形成肉眼可见的肿块；而在接种CaSki-As细胞的部位第3周时才能摸到有肿块形成，4周后形成肉眼可见的肿块。到第7周时，接种CaSki细胞的一侧可见肿块较大，其平均直径约为2cm而接种Caski-As细胞的一侧肿块较小，其平均直径均为lcm(图1)。用t检验计算CaSki-As细胞和CaSki细胞形成的肿块大小的差异，P

＜0.01，说明CaSki-As细胞在裸鼠上成瘤大小与CaSki细胞有着明显差异。可见HPV-16 E6E7反义RNA在使宫颈癌细胞株CaSki恶性程度降低方面起重要作用。

图1接种癌细胞的裸鼠左侧接种CaSki细胞，右侧接种CaSki-As细胞(第7周)

fig. 1Nude mice inoculated with carcinoma cells

the left side of the nude mice body was inoculated with CaSki cell and the right side with caSki-As cell (at 7th week)

图2转染细胞中反义RNA存在状况的Southern blot分析

a：lkb梯度DNA分子量参照物(BM公司)；B和C：经BamH I消化过夜的CaSki细胞和CaSki-As细胞DNA；D和E：B和C中的DNA与地高辛标记的HPV-16 DNA探针杂交，箭头所示为CaSki-As细胞的一强杂交信号

fig. 2Southern blot analysis of the status of antisense RNA in transfected carcinoma cells

a：1kb DNA ladder. B,C: DNA of CaSki cell and caSki-As cell digested with BamHI respectively. D,E: DNA of lane B & C hybridized with digoxigenin-labeled HPV-16 DNA