关键词: 鸭乙型肝炎病毒；反义寡脱氧核苷酸；抗病毒治疗

【摘要】目的研究反义核酸的抗病毒作用。方法设计合成了针对鸭乙型肝炎病毒(DHBV)前S(PreS)基因区第951-968位核苷酸的硫代反义寡脱氧核苷酸(AS-ODN)，以20μg/g体重/日剂量对3只腹腔感染DHBV5.2毒株后，血清DHBsAg及DHBV DNA阳性鸭连续静脉注射10天，同时以等体积生理盐水注射另3只感染鸭作为对照。结果对照鸭注射生理盐水后，血清DHBsAg及DHBV DNA阳性未见明显改变，肝组织DNA Southern杂交在3.0与2.3kb左右杂交信号明显。注射AS-ODN鸭在10天后，2/3鸭血清DHBsAg及DHBV DNA量显著降低，3/3鸭肝组织中3.0kb左右的杂交信号显著减弱，2.3kb左右未见杂交信号。结论说明该段AS-ODN在鸭体内能部分抑制DHBV的复制与抗原表达。

Antisense oligodeoxynucleotide targeted at the pre-s region of DHBV could inhibit virus replication in vivo

He Lifang, Wu Xiangpu, Chen Changqing, et al. Department of Molecular Virology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032

AbstractTo study the antiviral effect of antisense oligodoxynucleotide (AS-ODN), AS-ODN phosphotioates targeted to DHBV Pre-S region (951-968nt) (5'-TATCTCCTCCATTGTTTG-3') was synthesized. Two day-old ducklings were infected i.p. with 150μl of DHBV (3×10⁸ copies/ml DHBV). After 12 dyas, 6 DHBsAg and DHBV DNA positive ducks were divided into two groups. In treated group, each duck was injected i.v. AS-ODN 20μg/gram weight/day for 10 dyas successively, while in the control group, each duck received the same volume of normal saline for 10 days. Sera from ducks prior to treatment and treated after 6, 10 days were collected, and after 10 days ducks were sacrificed and livers were examined. DHBsAg was significantly decreased in all three treated ducks after 10 days of AS-ODN treatment. One of these ducks showed decreased DHBsAg even 6 days after treatment. Two out of three treated ducks showed decreased serum DHBV DNA, while one remained unchanged. In contrast, none of the control group showed decreased DHBsAg and DHBV DNA did not change. By Southern blot, DHBV DNA in the liver significantly decreased in 2/3 of the treated ducks and decreased in the other duck. In all control ducks, DHBV DNA remained strongly positive. Data indicated that AS-ODN targeting at Pre-S region could partly inhibit the replication of DHBV.

Key words:Duck hepatitis B virusAntisense oligodeoxynucleotideAntiviral therapy

近年来，由于乙型肝炎病毒(HBV)分子生物学的深入研究，对HBV复制规律有了进一步的了解，抗HBV基因治疗已成为重要的研究方向。反义核酸是80年代发展起来的一种生物高技术，1978年Zamecnik等^〔1〕首次证实应用人工合成的互补寡核苷酸能抑制培养细胞中的Rous肉瘤病毒增殖，研究反义核酸的抗病毒作用引起了广泛的重视。近年来，国内外学者陆续报道了应用反义核酸在体外细胞培养模型中抑制HBV复制与表达的研究结果^〔2～5〕，但是对于体内反义核酸的研究报道甚少。本研究是根据我们已报道的针对HBV各重要基因区的反义寡脱氧核苷酸(AS-ODN)在细胞培养模型中筛选的结果，合成了针对鸭乙型肝炎病毒(DHBV)前S(PreS)基因区的硫代AS-OND片段，在实验感染鸭中研究其对DHBV复制表达的影响，为临床抗乙肝病毒治疗提供实验依据。

1材料和方法

1.1AS-ODN硫代衍生物的合成与纯化本实验采用的硫代AS-ODN序列是5-TATCTCCTCCATTGTTTG-3，与DHBV5.2 PreS基因区第951-968位核苷酸互补。合成反应采用亚磷酸三脂用N’N’-四乙基-连二硫代甲酰胺(TETD)进行磷原子加硫反应，反应结束后经聚丙烯酰胺-尿素变性胶电泳，Sephadex G50柱层析分离纯化，并经核磁共振确认其硫/氧比，证实在5’端和3’端各有两个位置硫代。然后抽干-20℃冻存。使用前用灭菌生理盐水溶解，过滤除菌，配制成终浓度为5mg/ml备用。

1.2DHBV毒种为获得经核苷酸测序的克隆化的DHBV毒株供感染用，将克隆的pSP65DHBV5.2双体DNA(由Robinson博士转赠)扩增纯化后，取20μg加DEAE-Dextran混合，开腹直视下注入肝脏转染2日龄鸭，2周后转染鸭血清DHBV DNA阳性，再取DHBV DNA阳性血清500μl腹腔感染2日龄鸭获取大量DHBV5.2DNA阳性血清，-70℃保存作为本次实验感染用毒种。测定该血清DHBV浓度为3×10⁸拷贝/毫升。

1.3DHBV感染鸭出壳当天的纯种樱桃谷鸭(购自上海市稳得福禽蛋公司)，经胫静脉取血用DOT-EIA法筛选出血清鸭乙肝病毒表面抗原(DHBsAg)阴性的2日龄鸭26只，每只腹腔注射DHBV5.2DNA阳性血清150μl，监测其血清DHBsAg情况，12天后随意选用DHBsAg及DHBV DNA阳性鸭6只，分成两组(2，5，13号为对照组；3，6，18号为注射AS-ODN组)进行研究。

1.4AS-ODN注射方法将两组鸭分笼饲养，记录每只鸭的体重，注射组每日按体重20μg/g静脉注射连续10天，对照组注射等体积生理盐水。两组鸭在注射前及注射6天后分别采血一次，分离血清-30℃保存，注射结束次日放血，收集血清冻存，同时收集肝组织-70℃保存，部分肝组织经甲醛固定后送病理检测。

1.5血清DHBsAg检测根据文献^〔6〕的DOT-EIA法，用兔抗DHBs免疫血清及酶标葡萄球菌蛋白A(SPA)检测DHBsAg，用显色法显示结果进行判断。

1.6血清DHBV DNA检测使用阳离子尼龙膜(Boehringer Mannhein公司产品)先用2×SSC浸湿，置96孔抽滤装置中点样，每孔加20μl鸭血清，抽滤完毕后将膜取下，进行变性，中和，烤干处理后，用地高辛(DIG，Boehringer试剂)标记的DHBV全基因探针(按试剂说明自行标记)进行杂交，最后用光敏法在X光片上记录杂交信号。

1.7Southern转膜杂交检测肝组织中DHBV DNA本实验分别将6只鸭肝组织(1克/只)制成匀浆，酶消化后，用酚-氯仿提取，酒精沉淀后紫外分光光度计定量。每份肝组织取20μg总DNA，经EcoRⅠ酶切，1%琼脂糖凝胶电泳转膜后，用³²PdCTP标记的DHBV全基因探针(比活性5.5×10⁶cpm/μg)进行杂交，经放射自显影，X光片显影定影后，观察杂交信号。

2结果

2.1硫代DHBV PreS AS-ODN对感染鸭血清中DHBsAg表达的影响两组鸭血清DHBsAg检测结果对比，发现对照组(2，5，13号)鸭血清中DHBsAg表达量未见明显波动。AS-ODN注射组(3，6，18号)在注射6天后，2/3鸭(3，6号)血清DHBsAg表达量降低；注射10天后，3/3鸭血清DHBsAg表达均有改变，其中3，6号鸭的表达量继续下降，尤以6号鸭为显著，18号鸭血清DHBsAg的表达也出现减弱(图1)。

2.2硫代DHBV PreS AS-ODN对感染鸭血清中DHBV DNA的影响用斑点杂交法检测的结果(图2)对照组鸭血清3/3 DHBV DNA持续阳性。AS-ODN注射组2/3鸭(3，6号)在注射6天后杂交信号减弱，注射10天后杂交信号继续减弱，尤以6号鸭最明显，显示鸭血清中DHBV DNA水平下降，而18号鸭血清DHBV DNA水平未见明显改变。

图1DHBV PreS AS-ODN治疗感染鸭的血清DHBsAg检测结果

2，5，13：对照组；3，6，18：注射AS-ODN组

a：注射前；B：6天后；C：10天后；D：阴性和阳性对照

fig.1Effect of antisense oligodeoxynucleotide on the expression of DHBsAg in serum of infected ducks

2，5，13：Control ducks. 3，6，18：AS-ODN treated ducks

a：Before treatment. B:After 6 days of AS-ODN treatment. C：After 10 dyas of AS-ODN treatment. D：Negative and positive control

图2DHBV PreS AS-ODN治疗感染鸭的血清DHBV DNA检测结果

2，5，13：对照组；3，6，18号：注射AS-ODN组

a：注射前；B：6天后；C：10天后

fig. 2Effect of antisense oligodeoxynucleotide on the DHBV DNA in serum of infected ducks

2，5，13：Control ducks. 3,6,18: AS-ODN treated ducks.

a: Before treatment. B: After 6 days of AS-ODN treatment. C: After 10 dyas of AS-ODN treatment

2.3硫代DHBV PreS AS-ODN对感染鸭肝内DHBV DNA复制的影响肝组织总DNA Southern转膜杂交检测结果，对照组鸭肝内在3.0kb左右存在明显的DHBV dNA杂交条带，在3.0kb以下呈分子量不均一的拖带，在2