关键词: 痘苗病毒；痘病毒生长因子；真核表达；原核表达

【摘要】目的为了进一步探索VGF的生物学功能方法分别构建了痘苗病毒天坛株生长因子(Vaccinia growth factor, VGF)基因细胞膜外结构域(VGFsl)的真核及原核表达系统，在相应的细胞中获得了单独表达(真核)和融合表达(原核)。结果初步纯化的VGFsl表达产物能够与上皮生长因子(EGF)的受体结合，并刺激受体中酪氨酸残基发生磷酸化反应。与EGF相比，VGFsl表达产物刺激EGF受体自身磷酸化的能力更强。结论上述结果为VGF在病毒感染过程中的作用以及VGF作为新型多肽类药物的研究提供了有价值的线索。

Expression of secreted legand domain of vaccinia growth factor encoded by vaccinia virus strain Tian Tan in E.coli and insect cells

Jin Qi,Yang Tianbing Hou Yunde. National Laboratory of Molecular Virology and Genetic Engneering, Beijing100052

AbstractVaccinia virus growth factor (VGF) is encoded by an early gene of vaccinia virus strain TianTan located near the border between the terminal inverted repeats and the internal region of the viral genome as one copy. Its relationship to members of epidermal growth factor superfamily was discovered when computer searches of protein sequences revealed that VGF has strong sequence homology with these growth factors. To further get insight into the biological activity of VGF, we cloned and expressed the secreted legand domain of VGF (VGFsl) encoded by vaccinia virus strain TianTan in E.coli and insect cells. The results of biological activity test indicated that expressed products is capable of binding to the EGF receptor, and stimulating EGF receptor tyrosin autophosphorylation to a level greater than that of EGF.

Key words：Vaccinia virusVaccinia growth factorExpression

VGF是痘苗病毒基因组编码的一种属于EGF超家族成员的Virokine^〔1〕。其前体分子具有典型的Ⅰ型膜蛋白的特点，由多肽的氨基端至羧基端依次排列着信号肽(1-19位)、可分泌出细胞外的EGF受体的配体(膜外结构域)(20-96位)、跨膜区及胞浆内结构域(105-124位)^〔2〕。当前体分子分布于细胞表面后，由蛋白酶将其切割成为含有77个氨基酸残基的成熟分子，后者通过与EGF受体结合发挥生物学作用。有关VGF的生物学功能，已有多种假说提出。主要涉及两个方面：感染细胞分泌的VGF可能用于刺激邻近非感染细胞的代谢，为病毒的感染和繁殖提供一个有利的微环境^〔3〕；通过识别和结合靶细胞表面的EGF受体，为病毒提供一种感染途径^〔4〕。

本研究构建了VGFsl，即分泌型EGF受体的配体的表达质粒，并分别在真核及原核系统中得到表达。以刺激EGF受体自身磷酸化实验比较了EGF、VGFsl和VGFsl融合分子的生物学活性。

1材料和方法

1.1VGFsl融合分子原核表达质粒的构建以病毒完整基因组为模板，利用常规PCR反应扩增编码VGFsl的片段，所用引物为：5’GAAGATCTTCATGGATAGTGGTAACG-3’和5’-CGGAATTCCGTTAAGTGTTTGGTTTTC-3’。PCR产物经限制性内切酶水解及SPIN-X purification filter(COSTER公司)纯化后克隆至载体Bluescript Ⅱ ks。核苷酸序列测定证实扩增的VGFsl片段正确。利用EcoR Ⅰ和Bgl Ⅱ两个位点将VGFsl片段克隆至表达载体pGEX-5X-1谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferase; GST)基因3’端的多克隆位点中，构建了GST-VGFsl融合蛋白的原核表达质粒。

1.2VGFsl分子杆状病毒表达质粒的构建以引物5’-GAAGATCTTCATGTTGATAAATTATC-3’和5’-CGGAATTCCGTTAAGTGTTTGGTTTTTC-3’，PCR扩增带有信号肽的VGFsl片段。参照1.1中所述的方法鉴定和纯化PCR产物，并将其与线性pFastBacl(Bac to Bac系统，Gibco公司)连接。转化到DH10Bac菌内完成与穿梭质粒Bacmid的同源重组。重组的Bacmid经PCR鉴定，构建了带有信号肽VGFsl的杆状病毒表达系统。

1.3表达条件pGEX-5X-1/GST-VGFsl以BL21为宿主菌，在终浓度1mmol//L的IRTG诱导及低盐LB培养基中获得高效表达。pFastBacl/VGFsl在昆虫细胞Sf9中得到高效表达。

1.4表达产物生物学活性的检测1U EGF受体(Promega公司，100U/ml)与10μlrhEGF(GIBCO BRL公司)或纯化后的表达产物混匀，室温反应1小时，在冰浴中加入1μl³²p-ATP，继续反应10分钟。然后加21μl 2×加样缓冲液，100℃加热2分钟。在7%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，干胶后对X光片曝光。

2结果

2.1pGEX-5X-1/GST-VGFsl的表达GST-VGFsl经过IPTG诱导6小时后，在BL21细胞中达到最大的表达，其表达量接近菌体蛋白的25%(图1)。表达产物的N端为谷胱甘肽转移酶，C端为VGFsl。表达产物均以包涵体的形式存在。分离的包涵体经尿素等裂解后，利用连接有谷胱甘肽的Sepharose 4B亲和层析柱分离纯化GST-VGFsl融合蛋白，然后可进一步用Xa因子将GST与VGFsl多肽分离。

2.2pFastBacl/VGFsl的表达VGF与EGF不同，其分子含有两个N型糖基化位点。我们采用Bac to Bac表达系统，试图得到部分糖基化的分泌型VGFsl蛋白。pFastBac1/VGFsl在昆虫Sf9细胞中得到表达(图2)。但在检测表达产物时发现只有很少一部分VGFsl蛋白被分泌到培养基中，大部分仍在细胞内。

图1 pGEX-5X-1/GST-VGFsl表达产物的SDS-PAGE

fig. 1SDS-PAGE of expressed GST-VGFsl in E.coli

图2pEasBac1/VGFsl表达产物的SDS-PAGE

fig. 2SDS-PAGE of expressed VGFsl in insect cells

2.3VGFsl分子刺激EGF受体自身磷酸化当EGF受体的配体与其结合后，通过诱导受体分子的酪氨酸磷酸化来启动整个信号传导系统。用rhEGF、GST-VGFsl和VGFsl所作的平行实验表明：三者均能使EGF受体(分子量大约为170kDa)发生自身磷酸化。

3讨论

EGF超家族成员属于信号蛋白。从局部组织或血液中释放后，通过与其受体作用来刺激靶细胞的增殖和迁移。以旁分泌、内分泌及自分泌方式控制生长、分化、免疫、肿瘤、造血、伤口愈合、胚胎发育、神经损伤修复等过程^〔5〕。

痘苗病毒基因组编码VGF的基因作为早期基因在病毒感染的最初几小时表达。VGF分子不仅在蛋白的高级结构上具有EGF超家族成员的特点，而且其一级结构中含有该家族成员所特有的保守序列CX₇CX_4-5CX_10-13CXCX₈CX^〔6〕。除此之外，血清学实验还发现：VGF能够与抗鼠EGF抗体反应，但是与抗人EGF抗体反应较弱^〔7〕。目前的研究已经证实VGF可以以较EGF更强的亲和力与EGF的受体结合，并且刺激受体本身的酪氨酸残基磷酸化，启动整个信号传导系统^〔8〕。

本研究建立了VGFsl和GST-VGFsl融合分子的原核及真核表达系统，并对表达产物的生物学功能进行了检测。根据实验结果，我们得出以下结论：①VGFsl分子的糖基化与否对其作为EGF受体配体的功能影响不大；②VGFsl的融合蛋白(VGFsl位于融合蛋白的C端)依然具有VGF的生物学活性；③原核及真核表达的VGFsl分子刺激EGF受体自身磷酸化的能力相近；④以刺激EGF受体自身磷酸化作为判断指标，VGFsl的活性不低于EGF，可能还较EGF高(因实验中所用rhEGF为进口纯品，而表达产物只经过初步纯化)。

VGFsl真核及原核系统表达的研究为开发利用VGF作为型多肽药物等提供了一个参考背景，我们将继续对EGF和VGFsl在稳定性及生物学活性等方面的差异作进一步的探讨。

本研究为国家863高技术计划基金资助项目

1997年11月28日收稿12月31日修回

参考文献

1Brown J P, Twardsik D R, Marquardt H, et al. Vaccinia virus encodes a polypeptide homologous to epidermal growth factor and transfoming growth factor. Nature, 1985, 313: 491-492.

2金奇，黄静，杨天兵，等. 痘苗病毒天坛株基因组病毒生长因子基因结构的研究. 中华实验和临床病毒学杂志，1997，11(2)：104-107.

3Twardzik D R, Brown J B, Ranchalis J E, et al. Vaccinia virus infected cells release a novel polypeptide functionally related to transforming and epidermal growth factors. Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 82: 5300-5309.

4Eppstein D A, Marsh Y V, Schreiber A B, et al. Epiderm