关键词: 7型腺病毒；克隆；序列分析

【摘要】目的获得7型腺病毒(Ad7)载体构建的基本元件，为构建Ad7载体及阐明其基因组一级结构打下基础。方法用改良Hirts法提取Ad7 DNA，酶切后克隆于质粒载体，克隆了Xho Ⅰ A+D片段(17.0-76.5mu)、D片段(17.0-22.9mu)、E片段(10.8-14.1mu)、F+G片段(14.1-17.0mu)、G片段(15.8-17.0)，用EcoR Ⅰ+Xho Ⅰ双酶切，克隆了76.5-87mu，用Sam Ⅰ+EcoR Ⅰ双酶切，克隆了87.0-97.4mu。用腺病毒DNA做为模板测定了Ad7疫苗株右侧末端Sma Ⅰ H片段(97.4-100mu)核酸苷序列，根据所测序列设计引物，用聚合酶链反应(PCR)获得右侧末端，并对其再次测序证实。结果建立了Ad7疫苗株部分基因文库(10.8-100mu)，完成Ad7疫苗株Sma Ⅰ H片段核苷酸序列。结论这一结果为阐明Ad7基因组一级结构及构建Ad7载体奠定了基础。

DNA cloning of Ad7 vaccine strain and sequence analysis of its SmaⅠ H fragment

Zhou Jiehao, Qu Jianguo, Shi Changxin, et al. Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing100052

AbstractHuman adenoviruses have been a hot topic of study because of their potential utility for gene therapy and development of live viral vectored vaccines. Adenovirus types 4 and 7 have been given orally as vaccines for prevention of acute respiratory infections caused by these serotypes of adenovirus in U.S. army recruits for more than 30 years. Therefore, the advantage of using Ad4 and Ad7 as vectors in the development of oral live recombinant vaccine is obvious. For constructing Ad7 vector, 10.8-100mu DNA of Ad7 vaccine strain has been cloned. The Sma Ⅰ H fragment was sequenced using Ad7 DNA as a template and then the fragment was cloned by PCR. For verifying the sequence the fragment was sequenced again. The strategy we used to clone terminal end of adenovirus is reliable and practicable.

Key words：Adenovirus type 7CloningSequence analysis

7型腺病毒(Ad7)作为口服活疫苗已有30多年安全使用的历史^〔1，2〕，以Ad7疫苗株为基础构建的Ad载体已表达乙型肝炎抗原等外源基因并在动物实验水平取得良好结果^〔3～6〕，显示Ad7做为口服基因工程活疫苗载体的良好前景。Ad7E3区缺失载体构建的关键是右侧末端的克隆，同时，Ad7基因文库的构建及全序列分析是Ad7载体构建的重要基础。本研究的目的是克隆Ad7基因，获得Ad7右侧末端，为构建7型腺病毒载体奠定必要基础。

1材料和方法

1.1细胞和病毒A549细胞由病毒学研究所形态室保存，常规培养，生长液DMEM含10%小牛血清，青霉素100mg/L，庆大霉素10mg/L；维持液血清含量为2%。Ad7疫苗株，由美国Wyeth公司洪伯文博士惠赠。

1.2质粒和菌株pBluescript SK Ⅱ质粒为病毒学研究所形态室保存。pGEM-3Zf质粒购自华美生物工程公司。pGEM-T载体系统为Promega公司产品。DH5 α菌株为病毒研究所形态室保存。

1.3酶各种限制性内切酶，T4DNA连接酶，Taq DNA聚合酶分别购自华美生物工程公司，天象人生物工程公司，Promega公司，Biolabs公司和北京化学试剂公司。PCR引物由中国科学院微生物研究所合成。

1.4Ad7 DNA的大量制备用改良Hirts法，当感染Ad7的A549细胞出现60%～70%的CPE后，将维持液吸出。用1ml PBS洗2次，每瓶细胞加入0.8ml的裂解液(10mmol/L Tris, 25mmol/L EDTA, 0.5%SDS)，加入100μl蛋白酶K(0.5mg/ml)，37℃作用1h，每15min摇1次。再向每瓶细胞加入0.2ml 5mol/L NaCl，混匀后倒入离心管。缓慢反复倒置30次以上，4℃过夜或放置数小时。4℃ 15 000r/min，离心30min，收集上清，等量酚-氯仿抽提。无水乙醇沉淀，70%乙醇洗1次。真空抽干，溶与适量TE，过Sepharose-CL 4B层析柱，收集DNA峰，将收集的液体浓缩备用。

1.5以病毒DNA为模板直接测定序列利用低熔点琼脂糖回收的Ad7 EcoR I B片段做为模板，使用ABI377DNA自动测序仪测定腺病毒DNA序列。测序过程中设计了一条引物C2 5’-AACAGCCAACATAACCTC-3’。

1.6Ad7右侧末端的PCR扩增、克隆及测序PCR使用引物：Cl 5’-CTCTTTCATATTATCACC-3’和引物C3 5’-CTCTCTATATAATATACC-3’，EcoR Ⅰ酶切Ad7，回收B片段。以其为模板进行扩增，PCR产物用低熔点琼脂糖回收，克隆到pGEM-T载体系统中，转化DH5 α，挑取白色菌落，快提质粒，酶切鉴定。使用ABI377DNA自动测序仪测序。

1.7其它技术病毒DNA酶切，片段回收、连接，质粒DNA提取等分子生物学技术参见文献^〔7〕进行。

2结果

2.1AD7疫苗株基因的克隆

回收Xho Ⅰ酶切Ad7 DNA的各片段，克隆至Xho Ⅰ酶切的pBluscript SK Ⅱ(pSK)质粒。共获得5个克隆，分别是将Xho Ⅰ酶切Ad7 DNA的A+D片段、D片段、E+G片段、G片段克隆到pSK质粒中，分别命名为pSKAD(17.0mu-76.5mu),pSKD(17.0mu-22.9mu)，pSKE(10.8-14.1mu)，pSKFG(14.1mu-17.0mu)，pSKG(15.8mu-17.0mu)，经酶切电泳鉴定正确。见图1。

图1重组质粒pSKAD, pSKD, pSKE,pSKFG, pSKG的酶切鉴定

fig. 1Restriction identification of the recombinant plasmids pSKAD, pSKD, pSKE, pSKFG and pSKG

1：pSKAD/Xho Ⅰ.2:pSKD/Xho Ⅰ. 3:Ad7 DNA/Xho Ⅰ. 4:λDNA/Hind Ⅲ. 5:pSKE/Xho Ⅰ. 6:pSKFG/Xho Ⅰ. 7:pSKG/Xho Ⅰ. 8:pSK/Xho Ⅰ

图2重组质粒pSKBXE的酶切鉴定

fig. 2Restriction identification of the recombinant plasmid pSKBXE

1:pSKBXE/EcoR Ⅰ. 2:pSKBXE/Xho Ⅰ. 3:pSKBXE/EcoR Ⅰ+Xho Ⅰ. 4:λDNA/Hind Ⅲ

图3重组质粒pGES的酶切鉴定

fig. 3Restriction indentification of the recombinant plasmid pGES

1:pGES/EcoR Ⅰ. 2: pGES/Sma Ⅰ. 3:pGES/EcoR Ⅰ+Ⅰ. 4:λDNA/Hind Ⅲ

图4Ad7疫苗株SmaⅠH片段的核苷酸序列

fig. 4Nucleotide sequence of SmaⅠ H fragment on Ad7(vaccine strain) genome

回收Xho Ⅰ酶切的Ad7 DNA的B片段，再用EcoR Ⅰ酶切，回收小片段，克隆至Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切割的pSK质粒。命名为pSKBXE(76.5mu-87.0mu)。经酶切电泳鉴定正确。见图2。

回收EcoR Ⅰ酶切的Ad7 DNAB片段，用Sma Ⅰ酶切，回收大片段，克隆到用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切的pGEM-3Zf质粒中。重组质粒命名为pGES(87.0mu-97.4mu)。见图3。

根据Ad7 DNA97.4mu左侧附近核酸序列，设计引物Cl，根据右侧末端序列设计引物C3，将克隆质粒命名为pAD7TER，DNA序列分析结果与腺病毒DNA直接测序一致，克隆方向为Ad7 DNA97.4mu，在SP6启动子一侧。

2.2DNA序列测定结果

Ad7疫苗株Sam Ⅰ H片段(97.4mu～100mu)的核苷酸序列为1 047bp(见图4)。PCR克隆的腺病毒末端DNA序列分析结果与腺病毒DNA末端直接测序结果完全一致。

3讨论

腺病毒载体构建的难点之一是其右侧末端的克隆。由于腺病毒的两侧末端各有一个末端蛋白，一般的处理不能使末端蛋白与DNA分离。因此在克隆腺病毒基因组时，克隆末端是一个很棘手的问题。碱法^〔8〕克隆腺病毒末端DNA是经典方法，该方法先用NaOH处理腺病毒DNA，使双链DNA变性，末端蛋白从DNA上脱离，复性后再进行克隆，该方法很难掌握。近年来，PCR技术的建立和发展使基因的克隆变得很方便，但PCR技术的最大缺陷是其扩增产物容易发生变异，特别是在DNA序列未知的情况下，这种变异给以后的载体构建将造成困难。本文所设计的克隆策略较好地解决了这一问题，即直接测定腺病毒末端DNA序列，在获得腺病毒末端DNA准确序列的条件下，再用PCR方法克隆腺病毒末端DNA，通过测序筛选出正确的克隆，这一策略对腺病毒末端DNA的克隆有普遍意义。同时还获得了Ad7 10.8～97.4mu基因文库。这一工作为阐明Ad7基因组一级结构及构建Ad7基因工程疫苗载体打下了重要基础。

本文受国家863高科技生物技术领域基金资助

1997年7月8日收稿10<