摘要：以猪瘟病毒中国兔化弱毒疫苗株(CSFV C株)为实验材料，研究该病毒株在原代牛睾丸细胞中增殖的基本特性与规律。找到了一株能够使用免疫荧光技术进行检测的C株猪瘟病毒，并对病毒滴度的测定方法进行了改进，发展完善了荧光斑技术(F-PFU)。使用改进的病毒滴度测定方法，对接毒后培养上清中病毒滴度的变化趋势进行检测。在原代牛睾丸细胞中，接毒后5d，几乎所有的细胞都可被病毒感染；释放到培养液中有活性的病毒粒子达到10⁵F-PFU/mL以上，后维持在该水平。对原代细胞中细胞种类随代次增加的变化趋势进行了观察，并对CSFV的增殖特点及生产中出现的一收毒价不稳定、多次收获病毒等现象的机制进行探讨。并对影响猪瘟病毒增殖的因素进行了实验，不仅加深了对猪瘟病毒C株在原代牛睾丸细胞中增殖规律的了解，还为疫苗生产中猪瘟病毒产量的提高提供新的思路。

中图分类号：S852.651文献标识码：A

文章编号：1003-5125(2000)02-0170-10

Some Multiplication Properties of the Lapinized Chinese Strain (C strain) of Classical Swine Fever Virus in Primary Bovine Testicular Cells

WANG Zhen,LU Yu,DING Ming-xiao

(College of Life Science,Peking University,Beijing,100871,China)

Abstract:Some multiplication properties of the Lapinized Chinese strain of Classical Swine Fever Virus (CSFV C strain) in primary bovine testicular cells were studied.One CSFV C strain which can be detected by immunofluorescence technique was found and a new method in titering called flurescent plaque formation unit (F-PFU) was developed.It took about 5 days for all cells of primary bovine testis to be infected by CSFV and the titre of progeny virions in medium was 10⁵ F-PFU/ml from then on.The cell types of cultured bovine testicular cells changed along with cell passages.The mechanism of some phenomena in vaccine production was showed and some factors which effect the multiplication of CSFV C strain in primary bovine testicular cells were studied.Aknowledgements on the multiplication of CSFV C strain in primary bovine testicular cells were enriched and a new way to raise the titer of CSFV was suggested.

Key words:Classical Swine Fever Virus (CSFV); The Lapinized Chinese strain of CSFV (CSFV C strain); Immunofluorescence technique; Flurescent plaque formation unit (F-PFU); Vaccine production

猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)是一种危害严重的动物病毒，它引起的猪瘟每年给养猪业造成巨大的经济损失^［1］。目前世界上主要采用弱毒活疫苗免疫来防治猪瘟，以控制猪瘟的流行。在异源原代细胞中增殖的猪瘟兔化弱毒疫苗株(C株)是目前我国主要的弱毒疫苗。C株是我国五十年代经兔体传代选育出的一株具有良好免疫保护力的疫苗株。由于该疫苗株性能稳定、安全、保护性好，是国际上公认最好也是应用最为广泛的疫苗株。由于应用的需要，我国猪瘟病毒的疫苗生产也由兔脾淋巴疫苗、全乳兔疫苗逐步过渡到用组织培养生产的细胞疫苗。为避免猪体可能带有的病原体(包括病毒)对疫苗质量的影响，生产上一般使用异源细胞，如牛睾丸、羊睾丸、羊肾等原代细胞增殖CSFV C株疫苗^［2］。目前虽然在疫苗生产与使用中积累了丰富的经验，但研究工作多侧重于免疫接种程序及免疫效果等方面^［4～6］，而对病毒的增殖，特别是弱毒疫苗在原代细胞中的增殖规律还缺乏了解。比如在疫苗生产中，平均每个细胞的病毒产量少于1个病毒感染单位，那么，究竟是每个细胞病毒产量低，还是仅有少数细胞感染象这样最基本的问题尚不甚明了。

为此，我们使用猪瘟病毒弱毒疫苗C株感染的牛睾丸原代细胞作为实验体系，对病毒在原代细胞中增殖的规律进行研究。由于C株增殖力弱，较难用免疫荧光技术检测到感染细胞中病毒抗原的存在，生产上一直使用兔体温法检测C株病毒的滴度。我们在实验中通过比较不同来源的C株病毒，发现其中一株感染原代牛睾丸细胞后，宿主细胞质中能够检测到较强的荧光。从而为我们研究C株毒株在原代细胞中的增殖打下了基础。实验还对疫苗生产中出现的一些现象的机制进行了探讨。

1材料与方法

1.1细胞与病毒

1.1.1细胞：犊牛睾丸细胞由湖北生物制药厂提供。

1.1.2CSFV C株：中国兽药监察所提供的种毒，由广州生物制药厂在兔体上复壮生产的细胞毒。兔体半数反应量为10^-5。

1.2细胞培养及接毒条件

按常规细胞培养方法，用D-MEM培养液加10%无牛病毒性腹泻病毒抗体的胎牛血清作为原代牛睾丸细胞的培养液(pH7.2)。待细胞快长满单层时接毒，于37℃感染1h后，经Hank's洗涤，加维持液(pH为7.6～7.8)培养，维持液含2%的胎牛血清。

1.3免疫荧光检测方法

将细胞培养在盖玻片上，在病毒感染后不同时间，用0.01mol/L pH7.2的PBS缓冲液(含0.85%的NaCl)冲洗。放入纯丙酮中固定15min，自然干燥后用于免疫荧光检测或存于-20℃冰箱中备用。

固定后的细胞单层经与FITC标记的抗CSFV多抗于37℃温育1h，0.01mol/L pH7.2的PBS缓冲液冲洗后，甘油封片。或与CSFV的单克隆抗体温育，BSA封闭后，经FITC标记的抗鼠抗体(Sigma公司)温育、封片。用Olympus荧光显微镜于波长为495nm激发光下观察。

1.4病毒滴度的测定—荧光斑法(flurescent plaque formation unit,F-PFU)

将牛睾丸细胞培养在24孔培养板中的10×10mm盖玻片上，细胞长成良好单层时，用一定稀释度的CSFV C株样品37℃感染1h，Hank's液洗涤。将37℃保温的2×MEM维持液(含4%的血清)与融化后保温在45℃等体积的1.8%琼脂混合均匀，在每个培养孔中加入1mL，于37℃ CO₂培养箱中进行培养36h。去除覆盖在细胞表面的培养基凝胶，取出盖片固定后进行免疫荧光技术检测，统计荧光斑的数目，并根据下列公式计算病毒滴度：

F-PFU/mL=荧光斑数目/(病毒稀释度×接种量)

2结果

2.1CSFV抗原在病毒感染过程中的变化时相

使用CSFV感染次代牛睾丸细胞，接毒后每隔12h取样，并用免疫荧光法检测CSFV抗原在感染细胞中出现的时相及被感染细胞在整个细胞群体中所占比例。接毒后24h的样品中可观察到荧光阳性细胞。尽管荧光强度较低，但已能清楚地勾划出细胞的形态；而在接毒12h的样品中则检测不到荧光。

在接毒48～72h的样品中出现荧光较强的CSFV感染细胞。阳性细胞呈单个或几个相邻分散在单层细胞中，其数量只占整个细胞群体的少数，阳性细胞不超过细胞总数的10%。接毒后72～108小时是细胞群体中病毒感染的细胞数迅速增加的一段时间。在这段时间里，阳性细胞由单个分散存在扩展到成团分布，有的部位阳性细胞已连成片。阳性细胞率达到50%左右。继续培养，CSFV感染细胞继续增多，直至全部细胞为阳性(图1)，提示在CSFV C株疫苗的生产中，几乎所有的牛睾丸细胞都被病毒感染。

图1CSFV感染的原代牛睾丸细胞中占优势的纤维状细胞，箭头示细胞质相叠现象(免疫荧光技术检测)(400×)

Fig.1 The fibroblast-like cells in CSFV C strain infected cultured primary bovine testicular cells,overlaped cytoplasm of cells could be observed (Detected by immunofluorescence technique)(400×)

2.2荧光斑法检测CSFV滴度

由于感染CSFV的细胞经免疫荧光染色可检测到特异性荧光，结合噬斑测毒的原理，我们设计了使用琼脂封固与免疫荧光技术相结合的方法，统计病毒在细胞中扩散形成的荧光斑的数目，进而计算CSFV滴度。实践证明：“荧光斑(F-PFU)”法对细胞损伤小，琼脂的使用不引起显著的荧光本底，而且该方法与测定半数组织培养感染量(TCID₅₀)的方法相平行。因此我们使用这一方法测定并表示CSFV的滴度。

2.3CSFV C株在原代牛睾丸细胞中的增殖曲线

参照猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞培养疫苗制造及检测规程^［2］，在实验室中模拟疫苗厂对牛睾丸细胞的培养及病毒接种。接毒后分别在37℃培养，其间隔24h取样，测定释放到培养液中病毒的滴度，绘制病毒在原代牛睾丸细胞中的增殖曲线。同时，每4天收获全部培养上清，并换入新鲜培养液，从一收到五收。测定所有样品中病毒滴度，并绘制每收病毒生长的一步生长曲线(图2)。

由图可见，C株在37℃培养时，一收的滴度可达10⁵F-PFU/mL。此外，多次实验结果显示，接毒后，CSFV在原代细胞中增殖传播<