摘要：报道了文山松毛虫质型多角体病毒杀虫剂的研制，包括多角体的纯化、辅助剂的筛选、剂型研制、产品包装以及病毒杀虫剂的产品质量检测及生产等。该杀虫剂为乳剂，多角体浓度达2.5×10⁹PIB/mL；所选辅助剂取材方便、容易配制，对环境没有污染。经安全检测证明，无致病菌，符合国家卫生标准，对试验动物小白鼠无毒性和致病性。生物测定用1×10⁶PIB/mL感染2龄文山松毛虫幼虫，其死亡率平均为85.5%。

中图分类号：S482.3文献标识码：A

文章编号：1003-5125(2000)02-0149-07

Development of Dendrolimus punctatus wenshanensis Cytoplasm Polyhedrosis virus (DpwCPV) Insecticide

PENG Hui-yin,LIU Jia-xin,CHEN Xin-wen,XIE Tian-en

(Wuhan Institute of Virology,CAS,Wuhan 430071,China)

ZHOU Xian-min,YANG Chun-hua

(Guizhou Province Forest Academy of Sciences,Guiyan 550011,China)

SHENG Rui-ju

(Wuhan Health Control Station,Hankou 430022,China)

CHEN Shi-wei

(Yunnan Province Forest Academy of Sciences,Kunming 650000,China)

Abstract:The development of Dendrolimus punctatus wenshanensis Cytoplasm Polyhedrosis Virus (DpwCPV) insecticide is reported.The formulation is an oil-in-water emulsion and the concentration of polyhedrosis is 2.5×10⁹ PIB/mL.The auxiliary materials come from the agriculture products.It is safety and the viral insecticide contained no any pathogenic bacteria.The average mortality is 85.5% when the second instar larvae were infected by 10⁶ PIB/mL DpwCPV.

Key words:Dendrolimus punctatus wenshanensis Cytoplasm Polyhedrosis Virus (DpwCPV);Viral insecticide;Forestry;Formulation

文山松毛虫(Dendrolimus punctatus wenshanensis)属鳞翅目，枯叶蛾科。分布在云南(文山、红河、昆明等地)、贵州(兴义、望谟、盘县等地)，是林业的一种重要害虫^［1～3］。松毛虫(其中包括马尾松毛虫、云南松毛虫、赤松毛虫、文山松毛虫等)是中国林业的一种重要害虫，每年危害面积达800万公顷，给林业生产和环境带来了极大的危害。仅湖北省一年就有15万公顷松林被马尾松毛虫危害，湖南、四川等省受云南松毛虫的危害十分严重。广东、广西、福建等省主要受马尾松毛虫的危害。我们从1991年开始进行松毛虫病毒杀虫剂的研制，经过多年努力，取得了良好的效果。现将试验结果报道如下：

1材料与方法

1.1材料

文山松毛虫质型多角体病毒病死虫尸由云南省林科院提供^［4］。

文山松毛虫质型多角体病毒杀虫剂(简称DpwCPV-HL)由中国科学院武汉病毒研究所病毒室提供，多角体含量为2.5×10⁹PIB/mL。实验用纯系昆明小白鼠由中国科学院武汉病毒研究所实验动物饲养中心提供。

1.2方法

1.2.1差速离心提取多角体

将病死虫尸加适量无菌水置高速组织匀浆器皿中匀浆3min，取出按1∶10加蒸馏水，先用低速(500r/min)离心3min，除去沉淀和细胞组织碎片，取上清液再用高速(3500r/min)离心30min，收集沉淀用蒸馏水悬浮，重复交替使用上述方法2～3次，得较纯净的DpwCPV多角体置冰箱保存备用。

1.2.2DpwCPV多角体的计数

准确称取湿重1.0g提纯的多角体，以蒸馏水稀释成10mL，然后按10倍梯度依次稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，充分摇匀。用移液管吸取配制好的悬液置预先准备的血球计数板上，静止2～3min后，置光学显微镜下计数，采用五点取样法，以每个大格中多角体数目不超过30个为宜(比较不同的稀释度)，重复3次，取其平均值，所得结果按下述公式计算：

多角体浓度(PIB/mL)=五大格的多角体数×5×10⁴×稀释倍数

1.2.3辅助剂的筛选

筛选经济、取材方便、便于运输，在常温下保存三年不影响病毒活性的辅助剂。文山松毛虫质型多角体病毒杀虫剂主要为乳悬剂。

1.2.4DpwCPV-HL制剂的产品质量检测和安全性试验^［5～7］

将DpwCPV-HL制剂进行产品活性测定和安全性检测，对病毒原生物活性与制成产品后的生物活性进行比较，按常规毒力测定方法进行。同时，根据国际标准(FB4789、1-4789、24-48)对所研制的产品进行病原微生物的检测，检测的主要对象是沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌和细菌总数等八项指标。经检验合格后，再进行实验动物的急性试验，以保证产品的安全性和稳定性，按照Horn氏方法进行^［5］。

1.2.5微生物检验

按我国卫生防疫细菌检验方法进行逐项检查^［7］。

1.2.5.1杂菌总数检测取DpwCPV-HL制剂1mL注入无菌平皿中，同时取制剂1mL作10^-1～10^-9稀释，取各稀释液1mL分别注入无菌平皿中，再加入事先溶化并冷至45℃细菌培养基，摇匀，待冷却后放入37℃恒温箱培养24h，取出作菌落计数。

1.2.5.2大肠杆菌群检测用无菌吸液管吸取病毒制剂1、0.1、0.01、0.001mL分别接种到4支单倍乳糖发酵管中，经37℃培养18～24h，若有产酸产气管则转接伊红美兰平板，挑选可疑菌落做重复发酵试验，乳糖管不产酸不产气者即为大肠杆菌群阴性。

1.2.6致病菌检测取病毒制剂5mL加无菌水495mL，加化学沉淀剂，充分摇匀，静置60min，将上清液倒入另一无菌瓶中备用，取沉淀直接做下列菌的分离，按常规法作进一步鉴定。

1.2.6.1志贺氏菌直接分离法：取0.1mL沉淀直接用SS平板分离。增菌培养：取病毒制剂0.5mL接种10mL单倍9N增菌液，再取病毒稀释液100mL，接种100mL双倍GN增菌液，将上述二种培养液置37℃恒温培养箱中培养6～8h后，用SS和HE平板进行分离。

1.2.6.2沙门氏细菌检验沙门氏菌需先接种选择性不同的增菌培养基。取病毒制剂0.5mL接种于单倍SEM增菌液中，在37℃恒温箱中培养18～24h后用SS和HE平板分离。另取前述病毒制剂稀释液100mL注入双倍SEN增菌液，置37℃恒温培养箱中培养18～24h，再经SS，WS及麦康凯平板分离。

1.2.6.3耶尔森氏菌取沉淀0.5mL直接用麦康凯平板分离，置25℃培养48h。

1.2.6.4穹肠弯曲菌取沉淀0.1mL直接用布氏平板分离，置42℃培养48h。

1.2.6.5弧菌取病毒制剂0.5mL接种于10mL单倍硷胨水，另取前述病毒制剂稀释液100mL接种二倍碱胨水。然后分别装入37℃恒温箱中培养12h后转接大平板分离。

1.2.6.6化脓性球菌取沉淀0.1mL直接用皿平板分离，另取沉淀1mL接种10mL却浦曼增菌液置37℃恒温培养箱中培养22～24h后转接却浦曼平板。

1.2.6.7炭疽杆菌取沉淀0.1mL直接用平板分离。

1.2.6.8厌氧菌取沉淀1mL接种疱肉培养基增菌48h后转接皿平板作厌氧培养。

1.2.7动物急性毒性实验

动物急性毒性实验参照陈尔厚等^［4］方法进行，分为口服、灌胃、腹腔注射共三个处理，每个处理设实验2组和对照组2组，每组10只纯系昆明小白鼠，雌雄各5只，每只重18～20g。

1.2.7.1口服组

取1∶100倍DpwCPV-HL制剂稀释液1.6mL(每只用量0.32mL)，均匀拌入5粒固体饲料上，分别让5只小白鼠自然取食，隔日一次，吃完后再添加新鲜饲料。连续饲喂一周。其接种剂量按体重计为4×10⁸PIB/kg，相当大田使用浓度的160倍。口服对照组用不含DpwCPV-HL制剂的辅助剂作同样处理。

1.2.7.2腹腔注射组取DpwCPV-HL制剂稀释液0.32mL(约2×10⁶PIB)分别给小白鼠作腹腔注射，隔日一次，共4次，总有效剂量为4×10⁸PIB/kg体重^。只。腹腔注射对照组用不含DpwCPV-HL制剂的辅助剂作同样处理。

1.2.7.3灌胃组取DpwCPV-HL制剂稀释液0.32mL(2×10⁶PIB)分别给每只小白鼠作灌胃，隔日一次，共4次，有效剂量为4×10⁸PIB/kg体重^。只。灌胃对照组用不含DpwCPV-HL制剂辅助剂作同样处理。

2结果与讨论

2.1DpwCPV多角体计数

经纯化的多角体含量为5×10⁹PIB/mL。

2.2DpwCPV-HL制剂辅助剂的选择