摘要：特超强毒型648A株马立克病病毒(MDV)的囊膜糖蛋白I(gI)基因经PCR扩增后克隆进pUC18质粒载体，并对其ORF完成了DNA测序。与已发表的其它致病型毒株的糖蛋白I的DNA和氨基酸序列比较表明，648A株的gI基因序列与超强毒RBIB株已发表的ORF 5′端761个碱基完全相同。但是在该基因中完整ORF的1068个碱基中，648A株与强毒GA株间有8个碱基变异并导致7个氨基酸的变化，且这一变化主要发生在该基因的5′端，其3′端三分之一完全相同。

中图分类号：S852.65文献标识码：A

文章编号：1003-5125(2000)02-0180-08

Comparing DNA Sequences in Glycoprotein I Gene of Marek's Disease Viruses of Different Pathotypes

CUI Zhi-zhong,HE Liang-mei

(Dept.of Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China)

Abstract:The glycoprotein I gene (gI) of vv⁺MDV strain 648A was amplified by PCR,cloned and sequenced,its DNA and amino acid sequences were compared to published sequences of vMDV strain GA and vvMDV strain RB1B.The results indicated that the gI sequence of 648A was identical to the published 761 bases of 5′ side of ORF of strain RBIB,but there were 8 bases and then 7 amino acids different between GA and 648A strains.All these base changes located at the 5′-end of gI,about the one third of the 3′-end was identical in different pathotypes.

Key word:Marek's disease virus; Glycoprotein I gene; DNA sequence

30年来，随着抗马立克病(MD)疫苗的广泛应用和不断改进，在鸡群中流行的马立克病病毒(MDV)的毒力或致病性也在不断演化中。从60年代前流行毒株以弱毒(mMDV)为主，逐渐产生了强毒株(vMDV)、超强毒株(vvMDV)和特超强毒株(vv⁺MDV)^［1，2］。针对不同致病型毒株流行的鸡群应该选用的疫苗种类也不一样。为了鉴别不同的致病型毒株，目前还没有找到一种体外试验方法。

迄今为止，MDV的8个囊膜糖蛋白基因均已克隆和测序，但只在糖蛋白B基因(gB)才对不同致病型毒株进行了MDA序列比较。结果发现，该基因的DNA和氨基酸序列非常保守，几个mMDV、vMDV和vvMDV株的序列几乎完全一致(Ross et al.,1989^［3］; Lee et al.,个人通讯)；Heine et al.,1997^［4］；彭大新等，待发表资料)。鉴于vMDV的GA株糖蛋白I基因(gI)全序列和vvMDV的RB1B株gI的部分序列已发表^［5，6］，且已显出一些株间差异，本研究试图扩增和克隆vv+MDV的648A株^［2］的gI基因，进而比较分析分属vMDV,vvMDV,vv+MDV不同致病型的GA、RB1B和648A三株MDVgI基因的DNA和氨基酸序列，以探索从分子水平来区别不同致病型毒株的可能性。

1材料和方法

1.1特超强毒MDV株

648A株是迄今已发表的特超强毒MDV(vv+MDV)中毒力最强的一株病毒^［2］，从648A感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)提取的基因组DNA由美国农业部禽病和肿瘤学研究所提供。

1.2糖蛋白I基因的PCR扩增克隆和定序

1.2.1PCR引物为了从648A株病毒基因组DNA中扩增gI基因，根据已发表的强毒型GA株gI基因序列^［6］，设计并合成了一对引物：5′-CGATCTAGATAGACGGCGTGTGTGA(相当于gI的ORF上游的-24至-7并加入一个XbaI酶切位点)和5′-CTAACAGGTACCACCTACC(相当于ORF的+1105至此+1088，其中已含一个KpnI酶切位点)。

1.2.2PCR扩增按常规方法进行，程序为：在95℃变性5min后，按95℃(1min)、52℃(2min)和72℃(2min)做35个循环，最后在72℃下5min结束。PCR扩增产物在经酒精沉淀后再溶于少量TE缓冲液(0.01mol/L Tris,0.001mol/L EDTA,pH8.0)中。

1.2.3分别将PCR产物和pUC18质粒DNA经XbaI和KpnI双酶消化后作琼脂糖凝胶电泳后，从凝胶上切下相应大小的DNA条带，用QIAGEN公司的试剂盒从凝胶中回收相应条带的DNA。将经XbaI和KpnI双酶切的PCR产物及pUC18质粒DNA用连接酶连接后转化TG1株大肠杆菌。将转化菌接种在含ampicilin的LB琼脂平板上于37℃培养，分别取白色菌落在LB培养液中扩大培养后按常规方法提取质粒DNA，再用XbaI和KpnI双酶切后作琼脂糖凝胶电泳，根据插入DNA片段的大小来筛选阳性重组质粒。

1.2.4DNA测序，委托中国科学院上海植物生理所用DNA自动测序仪完成。

1.3蛋白质构象的比较分析

用SEQAID程序，对648A和GA二株病毒在gI蛋白质可能的亲水疏水性和二级结构的一些特性方面分别一一做对应比较。

2结果

2.1MDV的三个不同致病型毒株的囊膜糖蛋白I基因DNA序列比较

图1列出了特超强毒型648A株MDV的囊膜糖蛋白I基因ORF的DNA序列，文献中已发表的超强毒型RB1B株及强毒型GA株的序列也排列在一起作比较。图1可见，648A株(vv+MDV)gI的ORF在DNA序列上有8个碱基不同于GA株(vMDV)，且都发生在5′端，而3′端的三分之一完全相同。然而已完成并发表的RB1B(vvMDV)5′端的761个碱基则与648A株完全相同。

2.2MDV的三个不同致病型毒株的囊膜糖蛋白氨基酸序列比较

由三个毒株gI基因的DNA序列推测出的氨基酸序列见图2，在648A株与GA株间DNA序列上的8个碱基变化，有7个是有义变异，导致了相应7个氨基酸组成的变化，另一个碱基突变(在第552碱基)为无义突变。

2.3GA株和648A株gI蛋白质的亲水性、疏水性比较

用SEQAID程序对二个毒株的gI蛋白的亲疏水性比较表明，虽然每一个氨基酸变化都影响相应位点的亲疏水性，但以ORF的第176个氨基酸的变化的影响最大。如图3所示，在该位点，从648A株的疏水性亮氨酸(L)变为GA株的亲水性的组氨酸(H)后，使相临的170～176aa区由疏水性变为亲水性。

2.4GA株和648A株gI蛋白质二级结构相关特性的比较

不同毒株gI蛋白质上一些氨基酸的变化，也可能导致与蛋白质二级结构相关特性的变化，如α-螺旋(helix)或β-平板(sheet)及肽链折转(turn)或随机绕缠(random coil)等。由图4可见，在GA株和648A株间，由于在112和155位的氨基酸的变异(分别从G变为D和从V变为A)，可能导致在相应区域的肽链折转位点的移动和由β-平板结构变为α-螺旋结构(下双划线区)。

图1强毒超强毒和特超强毒株MDV的囊膜糖蛋白I基因ORF的DNA序列同源性比较。“-”表示同样碱基，GA和RB1B株序列来自Brunovskis(1994)和Ross(1991)，但发表资料中RB1B株的序列没有全部完成。

Fig.1 Comparing the DNA sequences in ORF of glycoprotein I genes from vMDV,vvMDV and vv⁺MDV.“-” indicates the identical bases.Data of GA and RB1B strains are from published date(Brunovskis et al.,1994; Ross et al.,1991),but the sequence of RB1B was not completed.

图2强毒(GA)超强毒(RB1B)和特超强毒(648A)株MDV囊膜糖蛋白I氨基酸序列比较

中“-”表示相同。RB1B株的序列原发表资料没有全部完成。

Fig.2 Comparing amino acid sequences of glycoprotein I from MDV strains GA (vMDV),RB1B(vvMDV) and 648A (vv+MDV).

“-”indicates the identical amino acid,the sequence of RB1B was not finished in the published data.

3讨论

根据HVT单价苗或HVT和SB1双价苗免疫的鸡群中用特定MDV毒株人工攻毒后MD的发病率，可以确定不同野毒株的毒力指数(virulent index)，不同毒力的MDV野毒株可区别为mMDV、vMDV、vvMDV和vv+MDV^［2］。以JM株和Md5株分别作为vMDV和vvMDV的参考株原型，如果在非免疫鸡群，其毒力指数小于JM株，则属于mMDV。HVT疫苗免疫鸡群，其毒力指数等于JM则属vMDV，大于JM株属vvMDV；HVT和SB1二价苗免疫的鸡群，其毒力指数等于Md5株则属vvMDV，大于Md5属vv+MDV^［2］。这些研究结果还证明，单用HVT疫苗只能预防vMDV型毒株感染，采用HVT和SB1二价苗只能预防毒力指数低于vvMDV型毒株感染，只有I型的CVI988/Rispens株疫苗才能有效预防绝大多数流行毒株、包括vv+MDV型毒株感染。 然而， 如果盲目地普遍应用CVI988/Rispens 株疫苗， 不仅会提高生产成本，而且有可能在鸡群中造成一种疫苗选择性压力，加速更强毒株的出现，这从流行病学角度考虑也是不<