摘要：合成引物扩增HIV-1 p24基因，并将其克隆到pQE-30质粒中，使其在大肠杆菌E.coli M15中以IPTG诱导高效表达，经SDS-PAGE分析，该表达产物约占菌体总蛋白20%，并且以可溶蛋白的形式存在于细菌裂解液上清之中。经镍离子柱亲和层析一步纯化，洗脱产物中p24蛋白纯度达95%。ELISA分析表明，该蛋白可与HIV感染者血清发生特异性免疫反应。以此蛋白交联Sepharose 4B，亲和层析纯化HIV感染者血清中的抗体，用所得抗体与HIV确认试剂反应，发现该纯化抗体仅与确认试剂中的p24蛋白反应。上述结果表明在大肠杆菌中已经高效表达了可溶性HIV-1 p24蛋白，该蛋白具有良好的抗原性。

中图分类号：R512.91文献标识码：A

文章编号：1003-5125(2000)02-0116-06

High Level Soluble Expressiion,One-Step Purification and Characterization of HIV-1 p24 Protein

TONG Yi-gang,DU Yong,XU Jing,et al

(Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071,China)

Abstract:The HIV-1 p24 gene (gag gene) was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into an E.coli expression vehicle pQE30 between BamH I and Kpn I sites.After induction with IPTG,the transformed E.coli strain M15 expressed the HIV-1 p24 gene efficiently.The recombinant p24 protein was expressed as a soluble protein,composing 20% of the total protein.After onestep purification with Ni-NTA⁺ affinity chromatography,the protein was purified to almost homogeneity.When applied to ELISA,the p24 protein exhibited good specific reactivity with sera of HIV-infected individuals.The antibodies against recombinant p24 protein from HIV infected plasma were purified and confirmed with HIV Western blot kit that the purified antibodies can only react with HIV-1 p24 antigen.It suggests that the recombinant HIV-1 p24 protein is suitable for assembling the HIV diagnostic kits.

Key words:Human immunodeficiency virus type-1; p24 protein; Gene expression; E.coli

原核表达系统是生产蛋白抗原的一种最为经济的手段，目前许多诊断试剂所用的抗原都是由大肠杆菌表达的。但是在高效表达的同时，目的蛋白往往会形成包涵体，这对蛋白的天然结构和抗原活性造成很大的破坏，而使包涵体中的变性蛋白溶解和复性往往是一个非常费时且效率很低的过程，经常会导致重组蛋白的大量损失。本文报道了在大肠杆菌中高效表达完整的可溶性HIV-1 p24蛋白，并且经一步纯化即可得到纯品。这为大规模生产HIV诊断试剂用p24蛋白提供了可靠保障。

1材料与方法

1.1质粒与菌种含HIV-1全长基因组的质粒pHIV由本室保存，该HIV-1基因组为HIV-1毒株NY5和LAV重组的前病毒基因组^［1］。质粒pQE30及其受体菌E.coli M15购自Qiagen公司。

1.2血清和血浆来源所有血清和血浆均由全军艾滋病检测中心提供，其艾滋病感染状况经过该中心的鉴定。这些血清和血浆均来自河北省固安县献血员。

1.3引物设计及PCR扩增根据HIV-1的序列，用OLIGO 4.0软件辅助设计一对引物，正向引物prm12:GAGGATCCCCCATAGTGCAGAACCTC。反向引物prm13:CCGGTACCTTAGAAAACTCTTGCTTTATG。PCR反应参照《分子克隆》^［2］进行，反应总体积50μL，含50mmol/L KCl,10mmol/L Tris^。Cl(室温下pH8.0)，15mmol/L MgCl₂,0.2mg/mL牛血清白蛋白，0.1%NP40，dNTP各200μmol/L，引物各1μmol/L，模板质粒pHIV 10ng，Taq DNA聚合酶2单位。94℃预变性3min后，按如下方式进行30次循环：94℃ 60s，58℃ 60s,72℃ 90s，最后在72℃延伸5min。

1.4HIV-1 p24基因的克隆将上述PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，用低熔点胶进行纯化^［2］，然后以BamH I/Kpn I双酶切，与以BamH I/Kpn I双酶切的载体pQE30连接，转化E.coli M15。快速筛选阳性克隆的方法如下：预先制备PCR反应液(配方同上，含缓冲液，dNTP,prm12,prm13,Taq酶，但不含模板DNA)，分装成小管，每管25μL。在转化平皿背面给待筛选的克隆标记号码，以吸头挑取菌落冲洗到PCR反应管中，按照上述的PCR方法进行PCR反应。

1.5HIV-1 p24基因在大肠肝菌中的表达取阳性克隆接种于6mL LB培养基(含50μg/mL氨苄青霉素和35μg/mL卡那霉素)中，37℃过夜培养，然后以1∶100稀释于200mL LB培养基(含50μg/mL氨苄青霉素和35μg/mL卡那霉素)中，于37℃振荡培养5h，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续于37℃振荡培养5h，离心收集细菌。

1.6重组p24蛋白的分离纯化用PBS(pH 8.0)悬浮离心收集的细菌，加入溶菌酶至终浓度0.1mg/mL，室温放置20min，超声破碎，10000g离心10min(4℃)，分别收集上清和沉淀。参照Qiagen公司说明书，利用自该公司购买的镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)进行亲和层析。

1.7SDS-PAGE以及ELISA分析SDS-PAGE参照《分子克隆》^［2］进行。ELISA分析方法如下：将纯化的p24蛋白稀释到2μg/mL，包被酶联板，每孔100μL，4℃过夜，以2%牛血清白蛋白封闭，4℃过夜，加入不同稀释度的血清，37℃孵育2h，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，37℃孵育2h后，以TMP显色。

1.8重组p24蛋白的特异性分析取500mL经诱导表达p24蛋白的菌液，离心收集细菌，超声破碎后，再离心收集上清，以镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)纯化p24蛋白，然后以此蛋白交联Sepharose 4B(CNBr-activated Sepharose 4B Lab Pack,Pharmacia Biotech)，操作参见产品说明。以此交联填料1克装柱，纯化250mL HIV感染者血浆中的抗体。用洗脱下来的抗体与HIV确认试剂HIV BLOT 2.2(Genelabs Diagnostics,western blot assay)反应，以未经纯化的同一HIV感染者血清作为对照。操作参见产品说明书。

2结果

2.1HIV-1 p24基因的克隆

用HIV-1 p24引物prm12和prm13从质粒pHIV上扩增HIV-1 p24基因序列，电泳检测表明：该扩增产物仅含一条带，长约0.7kb。用低熔点琼脂糖法回收，以BamH I/Kpn I双酶切，与双酶切的载体pQE30连接，转化E.coli M15菌株，随机挑选11个克隆，以prm12和prm13进行快速PCR筛选，结果7个克隆为阳性。进一步提取其中1号和5号质粒(分别命名为pQE24.1和pQE24.5)进行酶切鉴定，结果表明这两个质粒中BamH I/Kpn I之间有插入片段，其大小与HIV-1 p24 PCR片段的大小相当。根据p24基因的序列及载体pQE30的序列，可推测重组蛋白的氨基酸序列。图1比较了该重组蛋白与Gupta等人^［3］用pQE30表达的不可溶p24蛋白之间的序列差异。

2.2HIV-1 p24基因的表达及重组蛋白的可溶性分析

取上述克隆QE24.1和QE24.5，以1∶100接种到3mL含双抗的LB培养基中，37℃培养4h，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养4h，离心后弃上清，加入100μL蛋白载样液，100℃水浴3min，取20μL进行SDS-PAGE电泳，结果表明：与含空载体pQE30的细菌相比，重组子QE24.1和QE24.5有一条较强的特异表达带，其分子量约为24kDa，薄层扫描分析表明：该蛋白含量占菌体总蛋白的20.4%(图2)。取克隆QE24.1进行放大培养，收集细菌，超声破碎，离心分离上清和沉淀，分别进行SDS-PAGE分析，结果表明：重组蛋白主要存在于上清中，沉淀中几乎看不见p24蛋白带(图2)，说明该重组蛋白主要以可溶的形式存在。由于表达载体pQE30不带信号肽，因此重组蛋白应存在于胞浆中。

图1可溶性和包涵体HIV-1 p24蛋白的氨基酸序列比较

A，本文表达的可溶性p24蛋白的氨基酸序列； B，Gupta等人表达的包涵体p24蛋白的氨基酸序列^［3］；

*表示两序列不同； #表示半胱氨酸所在位置； 人工序列以下画线表示。

Fig.1 Sequence comparison between soluble and insoluble p24 protein synthesized in E.coli

A,Sequence of the soluble p24 protein in this paper; B,Sequence of the insoluble p24 protein reported by Gupta^［3］.

*indicates the amino acid difference.#indicates the Cys residue.The artificial regions are underlined.

图2重组HIV-1 p24蛋白的SDS-PAGE分析结果

1，蛋白质分子量标准； 2～3，含空载体pQE30的受体菌全细胞； 4～5，在IPTG诱导前后工程菌全细胞(4，诱导前；5，诱导后)； 6～7，经IPTG诱导的工程菌细胞提取物(6，上清；7，沉淀)； 8，工<