摘要：将构建好的可表达GST融合蛋白的重组病毒AcMNPV-OCC^--GST-6xHis-Etp28感染Sf9细胞，一定时间后取感染了病毒的细胞裂解物上清液进行SDS-PAGE分析，结果显示53kDa的融合蛋白(GST-6xHis-Etp28)呈不溶状态。在原有裂解液的基础上，加固体十二烷基肌氨酸钠至终浓度1.5%，并将Triton X-100的比例由1%提高到2%。SDS-PAGE结果显示至少有1/3的GST-6xHis-Etp28处于溶解状态，可溶性GST-6xHis-Etp28经亲合层析，53kDa的目标蛋白得到纯化。

中图分类号：Q939.4，Q786文献标识码：A

文章编号：1003-5125(2000)02-0143-06

Solubilization Analysis of GST Fusion Protein Expressed in Baculovirus System

YANG Lin,HUANG Bao-ying,WANG Quan-zhong,LONG Qing-xin,WANG Xun-zhang

(State key Lab for Biological Control,Biopharmaceutical Center,Zhongshan University,Guangzhou 510275,China)

LI Guo-qing

(Department of Animal Medicine,South China Agricultural University,Guangzhou,510640,China)

Abstract:Insect Sf9 cells were infected with constructed recombinant virus AcMNPV-OCC^--GST-6xHis-Etp28,which could produce GST fusion protein and the supernatant of 72 h pi cell lysate was examined by SDS-PAGE.The results showed that GST-6xHis-Etp28 fusion protein of 53 kDa was expressed in insoluble status.After the sodium salt of the alkylanionic detergent sarkosyl was added to insect cell lysis buffer to a final concentration of 1.5%,and the final concentration of TritonX-100 was increased from 1% to 2%,at least 1/3 of GST-6xHis-Etp28 appeared to be soluble,which was examined by SDS-PAGE.Then soluble GST-6xHis-Etp28 was purified by affinity chromatography using glutathione agarose.

Key words:GST fusion protein; Baculovirus expression system; Solubilization analysis

自从1983年Smith和Summers首次利用苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)表达人β-干扰素以来，至今已有数百种外源基因在杆状病毒载体系统中得到表达。由于杆状病毒载体表达系统具有较完备的翻译后加工修饰系统，如糖基化、磷酸化、蛋白酶特异性水解(如切除信号肽)和酰胺化等，还具有高效表达外源基因的能力，因此杆状病毒载体系统已成为最有应用前景的真核基因高效表达载体之一。

在应用杆状病毒系统进行外源基因的表达时，一个常用的转移载体是GST融合载体，这类载体将表达出GST融合蛋白。GST与还原型谷胱苷肽具有高度亲合性，因此可通过简便、高效的亲合纯化进行外源蛋白的分离纯化；此外，抗GST抗体可以对融合蛋白中的GST进行检测，从而使那些无法获得抗体的外源蛋白的检测成为可能。

应用原核系统表达GST融合蛋白时，往往会得到不可溶的表达产物^［1］，这就给表达产物的纯化、活性保证等带来了困难。本研究探讨了GST融合蛋白在杆状病毒系统中表达的可溶性状况，并进行了解决可溶性问题的研究。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1重组病毒重组病毒AcMNPV-OCC^--GST-6xHis-Etp28^［2］由本室构建。

1.1.2昆虫细胞、病毒和病毒基因组DNA含合成启动子和β-半乳糖苷酶基因的无包涵体粉纹夜蛾重组株(TnNPV-SVI^-G)由本室构建^［3］，草地夜蛾(Spodoptera frugiperda 9,Sf9)昆虫细胞引自英国自然环境研究会病毒研究所。

1.1.3其它生化试剂Glutathione Agarose Beads、Glutathione Powder、昆虫细胞裂解缓冲液(1×)、蛋白酶抑制剂混合物(50×)购自PharMingen公司。Acrylamide、Bis-acrylamide购自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1病毒扩增

大量培养Sf9细胞，待细胞长成单层处于对数生长期时用于病毒感染。具体操作包括：吸弃培养基，接种病毒，使病毒感染复数(MOI)小于1。室温吸附1h后除去病毒接种物，换以新鲜培养基，27℃培养48～72h，收集上清待用。

1.2.2表达产物的检测

1.2.2.1病毒定量感染和样品制备接种2×10⁶个处于对数生长期的Sf9细胞至25cm²细胞培养瓶中，使用高滴度病毒原液，病毒滴度(PFU/mL)至少为1×10⁸有效病毒粒子/mL，且病毒感染复数(MOI)控制在5～10之间。病毒接种细胞吸附1h后，弃病毒液，换以新鲜的培养基27℃培养72h后，移弃培养基，预冷的PBS(pH7.4)缓冲液洗涤细胞数次。除尽残留液体，再加入500μL预冷的细胞裂解液(含有1×Protease inhibitor cocktail)，用橡皮刮刮下细胞收集至eppendorf管内，置冰浴裂解45min，每50μL细胞裂解物分装至一个eppendorf管中，置于-20℃或者-80℃贮存备用或直接用于表达情况分析。

1.2.2.2SDS-PAGE分析将制备好的病毒感染的Sf9细胞裂解液上清取50μL，加入等量的蛋白质样品上样缓冲液(2×)，水浴煮沸5min，4℃、12000r/min离心5min，移取上清，在BioRad小型蛋白电泳装置上进行恒流电泳(SDS-PAGE电泳浓缩胶浓度为5%，电泳电流强度为18mA；分离胶浓度10%，电泳电流强度为34mA)。电泳结束后，考马斯亮蓝染色，观察蛋白质带型。

1.2.3GST-6xHis-Etp28的纯化

取适量Glutathione Agarose Beads,500g离心3～5min，弃上清并用5～10倍体积的PBS洗两次；加入细胞裂解上清液，于4℃轻摇摆30min，500g离心3～5min，弃上清，用5倍体积的PBS洗两次；加入1倍体积的GST Elution Buffer，室温放置2min，500g离心3～5min，收集洗脱液，内含纯化的GST融合蛋白。

2结果与分析

2.1重组病毒AcMNPV-OCC^--GST-6xHis-Etp28

重组病毒AcMNPV-OCC^--GST-6xHis-Etp28，系通过含有Etp28基因的重组转移载体质粒pAcGHLT-A-Etp28与线性化致死缺失型苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV-OCC^-)共转染Sf9细胞后构建而成^［2］。

2.2GST-6xHis-Etp28融合基因在Sf9细胞中的表达

将MOI约为3～10的重组毒株AcMNPV-OCC^--GST-6xHis-Etp28感染处于生长对数期的Sf9细胞，27℃培养72h后，用适量的细胞裂解液裂解贴壁的细胞单层，取适量的裂解液上清进行SDS-PAGE分析，可观察到感染重组病毒的细胞裂解液上清蛋白质样品比感染了TnNPV-OCC^-的细胞样品多了一条53kDa蛋白带(图1)。该蛋白带与预期的表达产物大小一致，表明融合的Etp28基因得到了表达。

2.3GST-6xHis-Etp28融合蛋白的表达特性

为了探讨GST-6xHis-Etp28融合蛋白的溶解状态，在按常规方法裂解完细胞后，将裂解液以12000r/min离心15min，裂解上清液加等体积蛋白质样品上样缓冲液(2×)，煮沸5min后待用；裂解沉淀物则用1×PBS洗涤两次，加与Lysis buffer同样体积的1×PBS，于冰浴中进行超声波粉碎，加等体积蛋白质样品上样缓冲液(2×)，煮沸10min后待用。

图1感染了重组毒株AcMNPV-OCC^--GST-6xHis-Etp28的Sf9细胞裂解物SDS-PAGE分析

Fig.1 SDS-PAGE analysis of the Sf9 cell lysate

1.Mid-range protein molecular weight marker;

2.The Sf9 cell lysate infected with TnNPV-SVI^G;

3～4.The Sf9 cell infected with different recombinant virus clonies of AcMNPV-OCC^--GST-6xHis-Etp28

(图中箭头所指示表达产物GST-6xHis-Etp28，以下图均同此标注)

SDS-PAGE结果显示，GST-6xHis-Etp28主要存在于裂解沉淀物中，即GST-6xHis-Etp28呈不可溶状态，在裂解上清中基本看不到GST-6xHis-Etp28(图2)。

图2GST-6xHis-Etp28溶解性质的SDS-PAGE分析

Fig.2 SDS-PAGE analysis of GST-6xHis-Etp28 solubility

1.Supernatant of Sf9 cell lysate infected with TnNPV-SVI^G;

2.Supernatant of Sf9 cell lysate infected with AcMNPV-OCC^--GST-6xHis-Etp28;

3.Insoluble pellet of Sf9 cell lysate infected with TnNPV-SVI^G;