摘要：应用电镜观察了黄瓜花叶病毒CMV不同分离物侵染寄主的细胞 超微结构变化。来自一串红(Salvia splendens)的不含卫星RNA分离物M-22侵染心叶烟，病毒粒子散布于细胞质，在液泡中形成大片病毒粒子结晶，液泡膜边缘产生小泡结构，完整的病毒粒子穿过胞间连丝在细胞间运转，胞间连丝中央部分有扩张现象。自然感染三生烟的含坏死卫星RNA分离物8-S1侵染普通烟，病毒粒子分散于细胞质，在液泡中未观察到结晶体，叶绿体产生囊泡结构，部分病毒粒子处在叶绿体空泡中。田间寄主上受8-S1侵染的三生烟细胞质中分布着大量球形病毒粒子，叶绿体也产生含有病毒粒子的囊泡结构。表明含有卫星RNA和不含卫星RNA的CMV分离物引起的细胞病变特征存在差别，可能是CMV卫星RNA参与病理变化的依据之一。

分类号：S432.41文献标识码：A

文章编号：1003-5125(2000)01-0066-07

Ultrastructural Alteration of Host Plants Infected with

Different Cucumber Mosaic Virus Isolates

HONG Jian, CHEN Ji-shuang, LI De-bao

(Institute of Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)

Abstract：The ultrastructural alterations caused by the infection of two cucumber mosaic virus isolates were investigated. Spherical virus particles of CMV M-22, an isolate originally from Salvia splendens, scattered through out the cytoplasm and aggregated into crystals in the vacuoles of tobacco cells. The existence of virus particles inside the chloroplast was not detected for this isolate. But virus particles were found being aggregated through the plasmodesma, that indicated the way of cell to cell movement of this isolate. Virus particles of CMV 8-S1, an isolate with necrosis satellite RNA and originally from naturally infected tobacco, scattered throughout the cytoplasm and in the vacuoles of abnormal chloroplasts. In the tobacco leaf cells natural-infected by CMV-8 in the field, numerous spherical particles and abnormal chloroplasts were observed. The results suggest that ultrastructural alterations induced by different CMV isolates are quite variable. This is a direct evidence of satellite RNA involve ment in pathogenic process by CMV.

Key words：Cucumber mosaic virus; Satellite RNA; Cytopathology; Electr on microscopy▲

黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)属雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)黄瓜花叶病 毒属(Cucumovirus)，是我国十字花科、茄科、豆科及葫芦科蔬菜最主要的病毒病原之 一。CMV的寄主范围很广，可侵染1000多种单子叶和双子叶植物，我国也已从38科120多种植 物上分离到CMV。近年来国内学者在CMV株系及亚组鉴定、卫星RNA、分子生物学研究以及病 害 防治等方面取得了重要进展^［1］，我们先后对来自十字花科、豆科、茄科作物及其 它花卉的不同CMV分离物进行了生物学、血清学和双链RNA比较研究^［2～5］。为了 解不同分离物侵染寄主的细胞病理变化差异，探讨卫星RNA影响寄主症状的超微结构机制， 我们对来源于一串红的CMV分离物M-22(不含卫星RNA)和来源于三 生烟的分离物8-S1(含坏 死型卫星RNA)所引起的寄主细胞超微结构变化进行了电镜观察，现将实验结果报道如下。

1材料和方法

1.1毒源

由一串红(Salvia splendens)上分离的M-22，经单斑分离纯化后人工接种于心叶烟( Nicotiana glutinosa)。由田间症状表现为饰纹、脉间严重坏死的三生烟(N.tabacum -Samsum)上分离的8-S1，经单斑分离纯化后人工接种于普通烟(N.tabacum)，该分 离物的原田间寄主编号为CMV-8。

1.2提纯病毒的负染色

适当稀释的病毒提纯液用2%醋酸铀水溶液(pH5.0)负染色，或者先经0.2%多聚甲醛固定，再 用2%磷钨酸(pH6.8)负染色。在CMV悬液中加入少量TMV样品，用来比较测量病毒粒子的大小 。

1.3寄主组织超薄切片

用以上两个分离物和一个田间寄主为实验材料，分别取典型花叶症状的寄主叶片黄绿交 界部位，切成1mm²小片，用Karnovsky’ 2.5%戊二醛-2%多聚甲醛混合固定液预固定2～ 4h，再按Hatta等人^［6］的方法，用2×SSC缓冲液配制的2μg/mL牛胰核糖核酸 酶RNase处理过夜，然后用1%四氧化锇后固定1～2h，常规脱水，Epon 812环氧树脂包埋， 超薄切片用醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色。

以上样品均在日本JEOL的JEM-1200EX型透射电镜下观察拍照。

2结果

2.1M-22分离物侵染心叶烟的细胞超微结构

由人工接种繁殖于心叶烟的M-22分离物经分离提纯后，用醋酸铀负染色的病毒粒子为球形 ，直径约30nm，呈现CMV粒子特有的“中心孔”结构，在电镜高倍放大下，可见表面的蛋 白质形态亚基(图1)。

图1提纯的CMV M-22分离物粒子，350000×

Fig.1 Purified virus particles of M-22, 350000×

由人工接种繁殖于心叶烟的M-22分离物经分离提纯后，用醋酸铀负染色的病毒粒子为球形 ，直径约30nm，呈现CMV粒子特有的“中心孔”结构，在电镜高倍放大下，可见表面的蛋 白质形态亚基(图1)。

在M-22接种感染的心叶烟叶片薄壁细胞及维管束组织中，大量球形病毒粒子散布于细胞质 中(图2)，高倍放大也能看到“中心孔”结构，粒子直径比负染时要小一些。细胞质中未见 到病毒粒子呈结晶状排列。病变的细胞有膜结构增生现象，在液泡膜边缘可见到一些内含纤 细丝状物的圆形或卵圆形小泡突入液泡中(图3)。有的细胞还有较大的膜状体紧邻液泡。细 胞的液泡明显增多，细胞质被大小不等的液泡分割成许多岛屿状，小液泡可以相互融合成大 的液泡，或者与细胞的中央液泡融合。病变严重的细胞产生空泡化现象，细胞器解体，病毒 粒子形成不同大小的聚集体，有的聚集体有膜包围。在中央液泡内可观察到大块呈结晶状排 列的病毒粒子(图4A，4B)，病毒结晶体呈多边形或不规则形，大小不等，有的可达数微米， 外周无膜。细胞核的形态无特殊变化，核内未观察到病毒粒子。线粒体内脊产生肿胀。叶绿 体多数呈正常的梭形，基粒片层和基质片层较发达，排列有序，有许多淀粉颗粒和质体小球 积累(图5)。在一些薄壁细胞的细胞壁上，观察到发达的胞间连丝结构，一些完整的病毒颗 粒处在胞间连丝中，有的胞间连丝中央部分扩展，容纳了多层病毒粒子。在紧邻着胞间连丝 的细胞膜处，观察到类似管状物的结构(图6)。

图2M-22分离物感染的心叶烟，示病毒粒子散布于细胞质中，55000×

Fig.2 Thin section of Nicotiana glutinosa leaf cells infected with the isolate M-22, showing virus particles scattered throughout the cytoplasm, 55 000×

图3M-22分离物感染的心叶烟，示液泡膜边缘的小泡结构(箭头)，65000×

Fig.3 Material as in Fig.2, showing virus-specific vesicles attached to the to noplast (arrow), 65000×

图4M-22分离物感染的心叶烟，示液泡中的病毒结晶体，4A.28000×，4B.46000×

Fig.4 Material as in Fig.2, showing large crystals of virus particles in the central vacuole, 4A.28000×, 4B.46000×

图5M-22分离物感染的心叶烟，示未显著病变的叶绿体，15000×

Fig.5 Material as in Fig.2, showing chloroplast with minor alteration, 15000 ×

图6M-22分离物感染的心叶烟，示处在胞间连丝中的病毒粒子(箭头)，75000×

Fig.6 Material as in Fig.2, showing virus partic