Key words Plant virus, Vector, Transmission, Molecular biology

1前言

植物病毒47个属中，被证实可通过天然生物媒介传播的病毒有40个属。植物病毒经空气传播(air-borne)的介体是昆虫和螨，而经土壤传播(soil-borne)的介体为线虫和真菌。此外，植物病毒传播还可通过寄主植物的种子(seed-borne)和花粉(pollen-borne)传播。

天然传播介体因其各自的生物学特性不同使其传播植物病毒的方式呈现不同的特点，且与被携带的病毒长期相互作用，形成特殊的传播机理。几十年来介体传播的机理和规律一直是植物病毒学研究的重要课题，并且已经积累了相当多的资料。然而，有关介体传播机理的分子水平的信息相对较少。近年来，随着分子生物学技术的发展，关于植物病毒与传播介体的分子水平的研究报道逐渐增多，现综述如下。

2昆虫介体(Insect vector)

2.1非持续性传播

马铃薯Y病毒属(Potyvirus)在自然界由蚜虫以非持续性方式传播。近年研究发现，两个由病毒编码的蛋白与介体传播有关：一个是外壳蛋白(Coat protein, CP)，另一个为辅助因子(Helper component protease, HC-Pro)^［1］，见图1。

图1马铃薯Y病毒属基因组(A)和与蚜虫传播有关的蛋白(B)

Fig.1 The genome of genus potyvirus (A) and the proteins related to the aphid transmission (B)

2.1.1外壳蛋白(CP)

植物病毒CP与蚜虫传播的关系早就有推测，直至Govier和Kassanis研究烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus, TEV)与马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)的HC的关系时才得到较为明显的证据^［2］。现已知道PVY CP的N端暴露表面的氨基酸三联子Asp-Ala-Gly (DAG box)保守区对蚜虫传播是必须的，并推测其为HC相互作用的功能区。烟草脉斑驳病毒(Tobacco vein mottling virus, TVMV)^［3］和西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)^［4］的CP基因突变分析，进一步明确DAG三联子在蚜虫传播中的作用。在TVMV CP中，这三个氨基酸任何一个缺失或替换，均能导致蚜虫传播特性明显下降或完全丧失。在DAG三联子不同位置的氨基酸能影响蚜虫的传播特性，第一位氨基酸是酸性或中性氨基酸(Asp或Asn)而不是碱性氨基酸有传播性。第二位为一个小的非极性残基(Ala)对传播是必须的，残基变大或极性增强对传播均产生负面的影响。第三位的甘氨酸(Gly)是影响传播的关键，变为任何其它氨基酸，即使是小残基的氨基酸如Ala，均能导致虫传性的丧失^［5］。虽然Potyvirus CP DAG下游的氨基酸并不表现为高度保守，但TVMV DAG下游的Lys替换为Glu、Arg或Asp时，也能影响蚜虫的传播功能^［6］。用胰蛋白酶切去TVMV CP N端包括DAG及下游区域的氨基酸，虽然感染的植物蚜虫传播性减弱，但纯化后的病毒其蚜虫传播能力并不受影响。因此DAG下游的近N端的残基除了参与蚜虫传播外，还可能与TVMV的生活周期有关^［5］。

2.1.2辅助蛋白(HC-Pro)

体外实验证明：纯化的TEV病毒粒子只能被那些预先用含有PVY HC因子的汁液饲养过的蚜虫传播，而用健康植物汁液预先饲养的蚜虫，却不能传毒，即使先饲毒而后再获取HC因子也不能传毒^［2］。从感染的植物中纯化HC组分，结果证明HC为蛋白组分，用部分纯化的来源于TVMV感染的烟草HC组分制备的抗血清，与TVMV基因体外翻译产物进行免疫沉淀，得到75 kDa蛋白^［7］。这个蛋白相当于TVMV多聚蛋白的N端部分，现已知为P1和HC-Pro部分，如辣椒斑驳病毒(Pepper mottle virus, PMV)体外翻译得到两个较小的蛋白，30 kDa(P1)和51 kDa(HC-Pro)^［8］。由不同的病毒纯化的HC-Pro的分子量为53 kDa(TVMV)至58 kDa(PVY)，在非变性条件下，有生物活性的HC-Pro蛋白为100至150 kDa，故认为其活性功能单位为均一双亚基结构^［9］。

将PVY的一个非蚜虫传播的HC缺陷株(称为PVC)与野生的PVY进行比较后发现，非虫传播PVC并不是缺失HC蛋白，因为在PVC感染的植物提取液中也能检测到迁移率与PVY HC相同的蛋白。比较二者HC基因的核苷酸序列有92%一致，仅相差24个核苷酸。进一步比较其相应的氨基酸序列，发现只有2个氨基酸被替换，即Lys⁵⁰→Glu，Ile²²⁵→Val^［10］，用点突变的方法证明了TVMV HC N端的Lys⁵¹→Glu改变，导致了蚜虫传播性的丢失，而与Ile²²⁶→Val无关系^［11］。Lys⁵¹被大部分氨基酸替代后均失去虫传活性，但对Arg替代却是允许的。此外，HC N端的His、Cys保守残基的改变，也影响虫传活性，有些甚至导致病毒失活^［12］。其它一些经人工接种数代后失去传播性的病毒株，如PVY-PTA，ZYMV和PVY-O，也发现在同样的位点(Lys)被其它氨基酸所取代，如PVY-PTA和ZYMV被Glu，PVY-O被Asn取代。在Cys-rich区，Gly→Glu变化也会造成虫传性的丢失^［13］，这些结构特点说明Lys⁵¹残基可能参与对生物活性二聚体形成所必须的离子相互作用；Cys和His保守排列也许有利于形成对虫传作用重要的结构或功能区——类锌指结构^［11］。在ZYMV HC的C端存在一个保守的Pro-Thr-Lys序列(PTK box)，其中Thr→Ala导致蚜虫传毒活性的完全丧失。在Lys-Ile-Thr-Cys(KITC box)中Lys也与蚜虫传播有关^［14］。这些位点之间要相互作用，直接或间接地(保持空间构象)参与蚜虫传毒过程的完成。

2.1.3CP和HC-Pro相互作用

早在1974年Govier和Kaissanis^［2］发现HC与蚜虫传播有关，从而就提出一种假说来解释这一现象，即认为HC作为一个双功能分子，一个功能区与病毒CP结合，另一功能区与蚜虫口器类似受体的部分结构。这一假说被称之为成桥学说(Bridge theory)^［15］。蚜虫在以非持续性方式传播病毒过程中，往往在很短的时间(5～10 s)内完成穿刺表皮和叶肉细胞、分泌唾液、探测和吸食汁液的过程。用电穿刺图象(EPG)技术记录整个过程，可以分为三个不同的时相。只有第二时相为真正的胞内期，此时相又可以分为三个不同的亚时相(Ⅱ-1，Ⅱ-2，Ⅱ-3)。唾液注入伴随病毒的接种发生在Ⅱ-1时相(仅1 s左右)，而吸食汁液伴随着病毒的获得发生在Ⅱ-3时相内(约4 s之内)^［16］。在如此短的时间内存在于汁液中的HC、病毒粒子(CP)和蚜虫口器上皮细胞受体，便发生快速的识别与结合过程。用透射电镜及免疫胶体金标记，观察发现TVMV和PVY的HC分子在蚜虫口器的下鄂食道表皮及前肠部位聚集并结合，而无单独的病毒粒子^［17］。另外PVY HC分子能够介导CP上具有完整的DAG结构的TEV粒子在蚜虫口针的顶端1/3处停留，而带突变DAG功能区的粒子则不能停留^［18］。这些结果均有力地支持了成桥学说，但是关于其相互作用的细微机理仍很少知道，也许HC组分是通过其N-端结构区的PTK box特异性，识别病毒粒子DAG位点或蚜虫口器内的受体。

但是用玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus，MDMV)的CP N端多肽与麦芽糖结合蛋白(Maltose-binding protein, MBP)在E.coli表达的融合蛋白预先饲喂蚜虫，能大大降低其蚜虫传播性^［19］。最近Blanc等应用蛋白印迹重叠(Protein blotting-overlay)方法分析TVMV的CP和HC的体外特异性结合发现：HC能够与虫传型的TVMV的粒子或单个CP亚基结合，但与非虫传型的不反应。TVMV CP (DAG)的一系列突变子的虫传性与其对HC的结合能力呈高度相关，并确定与HC结合最小的结构域为包括DAG在内的7个氨基酸(DTVDAGK)，位于TVMV CP从N端开始的2～8位的氨基酸^［20］，所以也不能排除病毒CP直接与蚜虫口器内的受体结合的可能性，也许在病毒感染的植物或蚜虫口器中，在HC蛋白辅助下，病毒CP N端发生折叠，暴露出N端的结构域(如DAG三联子等)，然后再与蚜虫口器内的受体结合。

2.2持续性传播

经蚜虫以持续性传播方式传播的病毒，主要有黄化病毒属(Luteovirus)的大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus, BYDV)、马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus, PLRV)、甜菜西方黄化病毒(Beet western yellow virus, BWYV)和耳突花叶病毒属(Enamovirus)的豌豆耳突花叶病毒(Pea enation mosaic virus, PEMV)等。BYDV有明显的介体特异性，根据蚜虫传播特异性可分为5个株系：PAV、MAV、RPV、SGV和RMV。Luteovirus在蚜虫体内以非增殖型循环方式存在，蚜虫从寄主韧皮部获得的病毒粒子要穿过蚜虫后肠(Hindgut, HG)上皮细胞进入血腔(Hemocoel)，然后穿过副唾液腺(Accessory salivary gland, ASG)细胞进入唾液管，最后在取食时从唾液分泌而感染新的寄主(见图2)^［21］。

图2Luteovirus在蚜虫体内的循环过程(据Chay, et al^［21］)

Fig.2 The circulation of Luteovirus in an aphid (from Chay, et al^［21］)

ASG： Accessory salivary gland(副唾液腺)；

PSG：Principal salivary gland