摘要腺病毒E1A基因诱导细胞凋亡，E1B19K基因及E1B55K基因抑制细胞凋亡，前者被克隆到腺病毒转移载体pCA13的HCMV IE启动子下游，构建成转移载体pCAE1A。采用lipofectin法将pCAE1A和含腺病毒基因组(E1区、E3区缺失)的质粒pBHG11共转染293细胞，7～10 d后得到重组病毒v5Ad4。用v5Ad4感染人肺腺癌细胞系A549，结果表明v5Ad4有明显杀伤和裂解肿瘤细胞功能。在人胚肺正常二倍体细胞中，v5Ad4没有表现出可见的细胞毒效应。

Construction of a New Kind of Recombinant

Adenovirus and Its effect on Tumor Cells

Su Fei Qi Bing Qi Yipeng

(Institute of Virology, Wuhan University, Wuhan 430072)

Abstract E1A gene of adenovirus is an apoptosis-inducing gene and E1B gene of adenovirus is an apoptosis-inhibiting gene. The former one was cloned into adenovirus transfer vector pCA13 under the control of HCMV IE1 promoter, which resulted into transfer vector pCAE1A. Plasmid pCAE1A and pBHG11, which includes almost all the adenovirus genome but E1 region and E3 region were deleted, were cotransfected into 293 cell line. After 7-10 days, recombinant virus v5Ad4(E1B^-E3^-) was obtained. v5Ad4 was used to infect A549 cell line. The results showed that v5Ad4 can kill and lysis tumor cells. In the normal cells, v5Ad4 didn't show visible cytotoxicity effect.

Key words Gene therapy for tumor, Adenovirus, E1A gene, E1B gene

迄今为止，恶性肿瘤治疗的主要策略仍然是手术、放疗和化疗。然而基于对肿瘤分子生物学的深入研究，近年来癌症的基因治疗作为一种新的治疗手段得到迅速发展。腺病毒(Adenovirus)载体由于基因组结构简单，遗传背景比较清楚，易于改造和操作，而且转染率高，又有较好的靶细胞特异性，因而作为向癌细胞导入外源基因的工具而备受嘱目。

腺病毒属DNA肿瘤病毒，基因组为线状双链DNA，长约36 kb。位于腺病毒5型194～358 bp处的Ψ因子为cis-元件，是包装病毒DNA必需的信号，它的缺失造成病毒基因组不能被包装，但不影响病毒基因组在被感染细胞中复制的可能性^［1］。早期基因E1A、E1B是复制必须基因，它们的缺失造成流产感染，但在293细胞(整合有腺病毒的E1区)中可以复制并形成病毒粒子。E3为病毒复制非必须区，常被缺失以提高腺病毒载体的克隆容量。目前，腺病毒主要被用作外源基因如抑癌基因Rb、p53,细胞毒性基因HSVtk^［2］，各种免疫刺激因子IL-2^［3］、IL-4^［4］、IL-6^［5］、GM-CSF^［5，6］、TNF、核酶等的瞬时表达载体。最近研究发现，缺失E1B55K基因的腺病毒能在p53基因突变的肿瘤细胞中选择性繁殖并裂解杀死肿瘤细胞，而在正常细胞中只能发生流产感染^［7］。为选择性杀死肿瘤细胞的腺病毒基因治疗载体的研究开辟了一条全新的途径。

研究表明，腺病毒E1A一方面具有转化功能，另一方面它的表达会延长抑癌基因p53的半衰期等，提高p53的表达量，引发p53依赖或不依赖的癌细胞凋亡^［8］，并显著降低多种人恶性肿瘤细胞系的致瘤性^［9］。近来研究证明，E1A的表达能下调在卵巢癌、乳腺癌、肺癌等常伴有的原癌基因HER-2/neu的过量表达，并抑制肿瘤及其转移，增加肿瘤对化疗的敏感性^［10］。E1B的两个表达产物19 k和55 k蛋白均可抑制p53依赖的凋亡，前者还可抑制p53非依赖的凋亡，并具有与bcl-2等同的凋亡抑制功效^［11］。E1B55k^-19k⁺的重组腺病毒12型引起p53表达量增高，半衰期延长，但不能引起人肺腺癌细胞系A549的凋亡^［8］。因而我们假设E1B的完全缺失可以使E1A的凋亡诱导效应不被抵消反而更显著，构建了仅缺失E1B和E3区的重组腺病毒v5Ad4，其中E1A的表达被增强，就其在癌细胞表达E1A，研究其对正常细胞与肿瘤细胞的影响。

1材料与方法

1.1菌株、细胞、病毒与质粒E.coli.TG1,DH5α为本室保存。人胚肾293细胞购自武汉大学典型培养物保藏中心，DMEM培养基加10%小牛血清常规培养。人肺腺癌细胞系A549购自上海细胞所细胞库，RPMI 1640培养基加10%小牛血清常规培养。正常人胚肺细胞由湖北医科大学董长垣教授惠赠，DMEM培养基加10%马血清常规培养。野生型腺病毒5型由南京军事医学科学研究所邓小昭教授惠赠。含E1A基因的质粒pCMVE1A由美国Pxutgers大学Elleen White博士惠赠。质粒pBHG11 ［E1^-E3^-Ψ^-。腺病毒5型基因组E1区的核苷酸序列188～1 339 bp(0.5～3.7 mu)被缺失，一个氨卞抗性基因(Ap^r)和一个细菌的复制起始位点(Ori)取代了这区域，同时缺失了病毒DNA必需的包装信号顺式元件Ψ因子，因而在单独感染293细胞时没有感染性。另外，此质粒中腺病毒5型E3区亦被缺失］、pCA13［E1-E3-Ψ+。含有腺病毒5型基因组22～5 790 bp(0～16.1 mu)核苷酸序列，但其中包含一个342～3 523 bp(1.0～9.8 mu)的序列缺失。缺失区内是一个用于外源片段插入的置于HCMV IE启动子(-299～+72 bp)控制下的多克隆位点，并跟随有SV40 poly(A)信号］，购自加拿大Microbix Biosystoms INC。

1.2酶和化学试剂lipofectin、T4连接酶、IPTG、X-gal购自GIBCO公司。限制性内切酶、马血清、RPMI 1640培养基、DMEM培养基购自华美生物制品公司。一般化学试剂均为国产分析纯。

1.3质粒DNA的提取、酶切、DNA片段的回收与连接按分子克隆的常规程序，稍作改动。

1.4重组DNA的转化和阳性重组子的筛选连接产物CaCl₂法转化大肠杆菌TG1。通过限制性酶切消化鉴定插入片段大小来筛选阳性重组体。

1.5共转染通过lipofectin介导，将含有E1A表达盒的转移载体pCAE1A和pBHG11共转染293细胞。具体操作为：将lipofectin 17 μL与pCAE1A 20 μg及pBHG11 20 μg分别用200 μL无血清无双抗(青霉素、链霉素)DMEM培养基稀释，室温静置15～30 min后，将lipofectin逐滴加入稀释好的质粒中并轻轻混合均匀。室温静置30～45 min使lipofectin包裹DNA。补加1.3 mL DMEM培养基，使转染混合液体积能均匀覆盖细胞层，混匀。将此lipofectin-DNA转染混合液缓慢加入经无血清无双抗DMEM培养基轻洗过的293细胞。温浴6～8 h，弃去旧培养基，换为含5%马血清的DMEM培养基继续培养2～4 d，观察细胞致病效应(CPE)。7 d后，取上清再次感染293细胞以扩增重组病毒。

1.6重组腺病毒和野生型腺病毒的感染分别取收获的上清3 mL加入A549细胞及正常人胚肺细胞中，37 ℃吸附1 h后，弃去旧培养基，加入新鲜的培养基，继续培养。

1.7电镜观察取pBHG11和pCAE1A共转染7 d后的293细胞上清，2 000 r/min离心，取上清制样。用2% pH6.2的磷钨酸溶液以滴染法对样品进行负染，220 000倍电镜观察。

2结果与讨论

2.1重组转移载体pCAE1A的构建与鉴定将pCMVE1A中含E1A基因编码区的EcoRI/BamHI 1.3 kb片段切下插入pCA13相应的多克隆位点，得到重组转移载体pCAE1A。pCAE1A经EcoRI/BamHI限制性酶切消化，释放出一条1.3 kb的小带，载体片段与pCA13/EcoRI和pCA13/BamHI单酶切所呈带形相等，证明是所需阳性重组体。酶切鉴定结果如图1所示；转移载体pCAE1A的构建过程如图3所示。

图1重组转移载体pCAE1A的酶切鉴定

Fig.1 Restricted enzyme degistion of recombinant

transfer vector pCAE1A

b and c: one 1.3 kb small fragment was released.

图2重组病毒v5Ad4的电镜观察

Fig.2 Electron microscopy of the recombinant virus v5Ad4

lcosahedron virus particle (arrow indicated) can be seen in supernatant of 293 cells cotransfected with pCAE1A and pBHG11 by the 220 000×electron microscope.

图3重组转移载体pCAE1A及重组病毒v5Ad4的构建

Fig.3 Construction of recombinant transfer vector pCAE1A and recombinant virus v5Ad4

E: EcoRI, B:BamHI, 1.3 kb open reading frame of E1A gene digested from pCMVE1A was inserted into EcoRI/BamHI site of vector pCA13, which resulted into recombinant tr