摘要根据HFRSV汉滩型(HTN)代表株76-118和汉城型(SEO)代表株R22基因资料，设计了两组引物，用电脑软件分析证明设计符合引物标准。以一组引物克隆全长S基因片段和N端的部分S基因片段，并使它们在T7系统进行融合表达和非融合表达。非融合表达产量虽不及融合表达高，但生物活性好。以非融合表达的两个S基因片段产物作间接ELISA的包被抗原，其工作浓度均达1∶10 000。用另一组引物建立了逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，检测我国不同地区由8种主要宿主分离的37个HFRSV毒株，2个阳性标准对照毒株和5个阴性对照标本，并与cELISA法比较，二者阳性检出率分别为100%和84.6%，符合率为84.6%，但前者比后者敏感性高15.4%。对其中20个毒株的PCR扩增产物先后用RsaⅠ和HindⅢ作二级酶切，建立了逆转录-聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(RT-PCR-RFLP)分型法。被定为HTN型的9株，SEO型的8株，余3株未能定型。此20个毒株曾用血清学方法分型，仅11株分型成功，与RT-PCR-RFLP法结果符合。分型成功率RT-PCR-RFLP法比血清法高30%。

Studies on Preparations of Nucleocapsid Protein Recombinant Antigen

and Genotyping of Hantaviruses

Tang Jiaqi Cao Min Wang Changjun Wei Chunbao Ye Chunyan

(Military Reserch Institute for Medicine and Technology of Nanjing Command. Nanjing 210002)

Abstract Two groups of primers were designed according to the gene backgrounds of prototype virus of HTN and SEO serotypes and corrected by computer. One group of primers was used to clone entire S genome segment and partial S genome segment with respect to N-terminal. The two cloned genes were fusionally expressed and non-fusionally expressed by T7 system. The non-fusionally expressed products whose working concentration were 1∶10 000 presented a good biological activity though their yields were lower than the fusionally expressed products. The other group of primers was used to establish a method of RT-PCR to detect RNAs of 37 virus isolates of HFRSV, 2 positeve standard viruses and 5 negtive controls. On comparision with that of cELISA, the detecting rates of two methods were 100% and 84.6% respectively, the coincidental rate was 84.6% while the former had a 15.4% higher sensitivity than the latter. The typing method of RFLP was set up by digesting the PCR products of 20 virus isolates with RasⅠ and HindⅢ resulting that 9 out of the total were HTN, 8 were SEO and 3 were not determined respectively. The same 20 viruses have been previoushy typed using serotyping method resulting that only 11 could be typed successfully, showing a high consistency with that of RT-PCR-RFLP method and a 30% lower typing efficiency than the latter.

Key words Hantavirus, Recombinant antigen, Genotyping, Restriction fragments length polymorphism (RFLP)

肾综合征出血热病毒(HFRSV)是布尼亚病毒科汉坦病毒属成员。目前已知该属至少可分为8个血清型，且其各型间均有交叉反应。其中的汉滩型(HTNV)与汉城型(SEOV)在我国野生动物中广泛分布和传播，并引起病死率较高的肾综合征出血热(HFRS)，因此倍受重视^［1］。HFRSV抗原检测、分型和流行病学目前还存在许多亟待解决的问题：现行的抗原检测法敏感性、简便性、特异性尚不理想，且无安全性好的优质抗原；分型方法不仅操作繁琐、费时，且对不少毒株不能准确分型；流行病学上对各型别的地理分布还不很清楚。有鉴于此，本研究研制了HFRSV的核壳工作抗原，建立了RT-PCR检测方法和RT-PCR-RFLP分型方法。

1材料与方法

1.1质粒与菌种含HFRSV 76-118株S基因片段cDNA的质粒由中国预防医学科学院病毒所杭长寿研究员惠赠；表达质粒pTSAPA^［2］由美国Cantor教授惠赠；质粒pEt-28a^［3］，菌株E.coli BL-21(DE3)系本室保存。

1.2引物的设计与合成根据报道的HFRSV 76-118株S片段cDNA序列，设计第一组引物：引物1 5′-ATG CAT GCG GCC GCT ACC ATG GCA ACT ATG GAG G-3′，与S片段cDNA34-52序列相同，含NcoⅠ位点；引物2 5′-GAT CGT CGA CTT AGA TCT AGA GTT TCA AAG GCT C-3′， 与S片段 cDNA 1324-1308序列互补，含Sa1Ⅰ酶切位点；引物3 5′-T TGT CGA CTC TTC TGC CTT CAT GCT-3′，与S片段cDNA 595-612序列互补，含Sa1Ⅰ酶切位点。根据HTNV 76-118株及SEOV R22株M片段cDNA序列，选取同源性较高的G1区设计第二组引物：引物4 5′-GCA TCA GTG AAG CCT TTT C-3′，与两型病毒cDNA 1199-1218序列相同；引物5 5′-GCA GAT GTG CCC AAC CAT G-3′，与两型病毒cDNA 1497-1478序列互补。上述引物设计经军事医学科学院王槐春设计的PCRDESN软件进一步分析，证明符合条件，由中国科学院上海植物生理研究所合成。

1.3试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶购自GIBCO BRL公司，PCR试剂盒购自上海生工生物工程公司。逆转录酶试剂盒为美国Promega公司产品。标准DNA和标准蛋白Marker及其他常规试剂均购自华美生物工程公司。

1.4毒株汉滩型标准株76-118、汉城型标准株R22由中国预防医学科学院病毒所杭长寿教授惠赠，本所Vero-E6细胞传代或鼠脑传代作为阳性对照；待检毒株：鲁胎(山东 病胎儿)、A537(福建 黑线姬鼠)、B5(浙江 病人血)、S35(上海 病人血)、A3(浙江 黑线姬鼠)、HR54(河南 褐家鼠)、H14(陕西 病人血)、鲁姚(山东 病人血)、R2(安徽、褐家鼠)、H3(湖北 病人血)、鲁徐(山东 病人血)、H5(安徽、黑龙江 病人血)、A96(安徽 黑线姬鼠)、C4(安徽 家猫)、R27(河南 褐家鼠)、R(安徽 大白鼠)、A216(四川 黑线姬鼠)、LR1(甘肃 病人血)、 Hubei(湖北 病人血)、A1018(湖北 黑线姬鼠)、L99(江西 黄毛鼠)、R178(福建 褐家鼠)、A16(陕西 黑线姬鼠)、R36(云南 褐家鼠)、R30(云南 褐家鼠)、C10(安徽 家猫)、B11(安徽 病人血)、S 45(上海 病人血)、A59(云南 高山姬鼠)、Rr(安徽 大白鼠)、Hu(山东 病人尿)、B9(安徽 病人血)、B78(山东 病人血)、E142(云南 滇绒鼠)、J10(辽宁 褐家鼠)、陈株(Chen)、A9共计37株由安徽省医学科学研究所倪大石教授惠赠，本所鼠脑传代保存；以未感染HFRSV的正常BALB/c小鼠鼠脑标本3份和正常Vero-E6细胞标本2份，共5份为阴性对照。

1.5血清和单克隆抗体HFRS患者血清6份由江苏省卫生防疫站惠赠，阴性对照血清3份采自非HFRS疫区的健康献血员。抗核壳蛋白单克隆抗体H5由第四军医大学徐志凯教授惠赠。

1.6重组质粒的构建用引物1和引物2扩增出S基因全长编码区片段，约1.3 kb；用引物1和引物3扩增出S基因部分编码区片段，约600 bp；分别用限制性内切酶NcoⅠ、SalⅠ酶切上述扩增的核苷酸片段和质粒载体pTSAPA及pEt-28a，以低熔点琼脂糖电泳回收目的片段，然后进行连接反应。用连接产物转化感受态宿主菌E.coli BL21(DE3)，挑取转化菌，提取质粒，用酶切法和PCR扩增法鉴定重组质粒。

1.7目的基因的诱导表达及表达产物的初步纯化加IPTG分别诱导1.5、3、4 h后收集菌体，加裂解缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl)、苯甲磺酰氯和溶菌酶，搅拌20 min，加去氧胆酸、DNaseⅠ，离心收集沉淀。用0.5% TritonX-100和10 mmol/L EDTA (pH8.0)洗涤、离心，收集沉淀后重新悬浮于适量水中。

1.8表达产物的鉴定SDS-PAGE电泳分析、Western-blot、间接ELISA法均按常规方法进行^［4，5］。

1.9RNA的提取按Piotr^［6］等的异硫氰酸胍一步法。

1.10RT-PCR从HTNV 76-118株感染的Veroc-E6细胞提取总RNA作为模板，RT-PCR反应条件经优化后确定如下：5×逆转录缓冲液4 μL，Rnasin 5 μL，10 mmol/L dNTPs 4 μL，引物Oligo dT 1 μL，AMV RTase 5 u，RNA模板1 μL，加灭菌DEPC水至20 μL，混匀后42 ℃逆转录2 h，95 ℃灭活RTase 5 min，向上述逆转录系统中加Taq酶0.5 μL，10×PCR缓冲液5 μL，引物4和引物5各1 μL，补加双蒸水至总体积50 μL，退火温度为57 ℃，变性温度及延伸温度分别为94 ℃与72 ℃，各步骤反应时间为1 min，共35个循环。RT-PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行分析。

1.11捕捉ELISA(cELISA)方法按文献［7］操作。

1.12限制性片段长度多态性分析(RFLP)分型法计算机检索、分析两型病毒M节段酶切位点发现，在扩增的核酸片段中，76-118株含2个RsaⅠ位点，1个HindⅢ位点；R22株含一个RsaⅠ位点，不含HindⅢ位点。因此，选择RsaⅠ和HindⅢ作为RFLP分析的内切酶。迅速加入约10 u限制性内切酶RsaⅠ或HindⅢ，37 ℃水浴3 h消化被分型毒株的RT-PCR产物；然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对酶切产物进行分析，用银染法显影。实验以76-118株和R22株的酶切产物作型标准参照，用DNA标准Marker作分子量参照，根据酶切产物片段的数目和大小，参照76-118株和R22株酶切<