摘要应用对虾白斑综合征杆状病毒(WSSV)，对淡水克氏螯虾、罗氏沼虾、日本沼虾和两种淡水蟹(中华绒螯蟹、长江华溪蟹)进行人工感染实验。结果除淡水克氏螯虾之外，其它受试的虾蟹均不能感染WSSV。克氏螯虾3个不同剂量组感染至12 d,平均死亡率为94%。从发病或死亡个体采集血淋巴，经电镜负染色可观察到完整的病毒粒子，其形态大小、靶细胞组织病理均与从中国对虾中分离的WSSV相似或相同。同时，通过原位杂交技术进一步证明该实验的可靠性。克氏螯虾重复感染效果良好，有可能成为研究WSSV的一种理想的病毒体内增殖模型。

Establishment of a Model for Proliferating White Spot

Syndrome Virus in vivo

Huang CanhuaShi ZhengliZhang JianhongZhang Liren

Chen DihuaJean Robert Bonami^*

(Joint Laboratory of Invertebrate Virology, Wuhan Institute of Virology,

The Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071)

^* (UMR219，CNRS-IFREMER DRIM,Universite Montpellier II,CC-80,

Place Eugene Bataillon,34095 Montpellier Cedex 5,France)

AbstractsWith white spot syndrome virus (WSSV) isolated from disease shrimp Penaeus chinensis, some of freashwater prawn and crabs: crayfish Cambarus clarkii， Macrobrachium rosenbergii, Macrobrachium nipponensis, Eriochier sinensis, Sinopotamon yangtsekiense were selected to be artificially infected. The result shows that only Cambarus clarkii can be infected by WSSV. The average mortality of three different dose groups (Group 1,2,3) was 94% during 12 days after injection. Intact viral particles can be seen from the hemolymph of dead or diseased crayfish using TEM negative staining, the shape of virion and their morphogenesis in host cell are quite similar or identical to the WSSV isolate. Hybridization in situ technique was used to confirm the reliability of the experiment. The result can be repeated using diseased Cambarus clarkii to infect the same kind of crayfish, it suggests crayfish Cambarus clarkii can be used as a good model for the further study of WSSV.

Key wordsWhite spot syndrome virus (WSSV), Freshwater prawn and crabs, Model of proliferating WSSV in vivo

近年来导致我国及亚洲太平洋地区对虾暴发性流行病的主要病毒病原是一种对虾无包涵体杆状病毒，又称对虾白斑综合征杆状病毒(WSSV)^［1］，它除了侵染绝大多数种类的对虾之外，还可侵染海洋生态体系中多种蟹类、龙虾类、端足类、水蝇类等甲壳纲动物，具有较广泛的宿主范围^［2］。为了解该病毒对淡水虾蟹类的侵染活性，同时为研究该病毒建立一个较合适的病毒增殖模型，我们选择了几种常见的淡水虾蟹类甲壳纲动物，以暴发性流行病中国对虾体内分离得到的WSSV为病毒病原进行人工感染试验，现将工作结果报道如下。

1材料与方法

1.1病毒来源及提取

病毒材料是1998年从宁波、唐海等地收集的。取病虾鳃附肢加10倍(W/V) TN(0.02 mol/L Tris-HC1,0.4 mol/L NaCl, pH7.4)缓冲液中捣碎、匀浆，上清液低速离心去粗渣，并用TN缓冲液4倍稀释。

1.2淡水虾蟹及人工感染实验

淡水螯虾(Cambarus clarkii)、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、日本沼虾(Macrobrachium nipponensis)、及淡水蟹：中华绒螯蟹(Eriochier sinensin)长江华溪蟹(Sinopotamon yangtsekiense)均从市场选购生命力较强的健康个体，实验前置水族箱中充气暂养3 d。一切正常后，每种虾按11尾/箱分4组，其中一箱设为对照；实验组(共3组)分别按0.1、0.2、0.3 mL剂量在第三腹节沿甲壳下注射，对照组注射0.2 mL生理盐水。蟹类每水族箱饲养3只，在附肢肌肉处注射0.2 mL病毒悬液，对照组注射0.2 mL生理盐水。感染72 h后，采集少量血淋巴，电镜与核酸探针(Digprobe)斑点杂交(Dot-blot)进行检测。将感染WSSV发病或死亡的虾(蟹)作毒源，对相应的种类再次重复感染。充气饲养，观察发病死亡情况。

1.3电镜样品制备

1.3.1负染色感染72 h后抽取各组虾或蟹血淋巴(加10%柠檬酸钠抗凝)，2% PTA负染色，样品待干后，在日立H-7000FA透射电镜下观察。

1.3.2超薄切片取72 h后各组虾或蟹胃、鳃、肝胰腺、中肠、及血淋巴等组织，迅速切成1 mm³小块(血淋巴经4000 r/min离心)，2.5%戊二醛-3%多聚甲醛预固定，1%锇酸后固定。梯度乙醇脱水，苯二甲酸二丙烯酯包埋，聚合后在LKB-2128型超薄切片机上切片，醋酸铀、枸橼酸铅双染色，电镜下观察拍照。

1.4Dig-核酸探针的制备与斑点杂交

核酸片段L46来自中国对虾WSSV基因组^［3］，长度1.5 kb，核酸探针制备与斑点杂交按照Boehinger Mannheim DIG High Prime Kit步骤操作。

1.5原位杂交程序

感染样品依Lightner^［4］方法进行包埋处理，切片厚度4 μm,粘附在多聚赖氨酸处理的洁净玻片(Polylabo)上，60 ℃融蜡30 min,甲苯(Sigma)脱蜡。依次100%、95%乙醇(各3次，每次5 min);80%、50%乙醇水化(3×10 dip)；ddH₂O 1 min; 37 ℃ 100 μg/mL蛋白酶K处理30 min;PBS漂洗2次，4%冷甲醛固定10 min;2×SSC漂洗10 min,每张玻片滴加500 μL杂交液(50%甲酰胺，0.2% Ficoll 400,0.2% polyvinylpyrrolidone, 0.2% BSA, 5×SSC，50 mmol/L Tris-HCl,pH8.0，1 mmol/L EDTA)预杂交3 h；42 ℃在含Dig探针10 ng/mL杂交溶液的湿盒中杂交过夜。杂交结束后，玻片在室温下依次2×SSC，1×SSC漂洗各2次，每次10 min。42 ℃依次0.5×SSC、0.1×SSC漂洗2次，每次30 min。

1.6原位杂交检测

玻片经 Buffer Ⅰ (100 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl pH7.5)漂洗5 min;37 ℃在Buffer Ⅱ (含1%封阻剂的Buffer Ⅰ)溶液中阻断30 min;Buffer Ⅰ漂洗两次，每次15 min。Buffer Ⅲ(100 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L NaCl, 50 mmol/L MgCl₂， pH9.5)室温平衡5 min;BCIP-NBT显色0.5～3 h,0.1×TE终止反应，梯度乙醇脱水，最后用100% 甲苯置换2次，每次5 min。Eukitt封片、镜检，阳性信号呈明亮的兰紫色。

2结果

2.1感染72 h后，各组随机抽样检测，除淡水螯虾之外，其它受试的淡水虾蟹均未见病毒粒子。核酸探针斑点杂交结果如图1所示： 克氏螯虾感染组(低倍剂量组)72 h后可检测到强烈的杂交信号(1a);以发病或死亡螯虾作毒源进一步感染同种螯虾，72 h后亦可检测到明显杂交信号(1c)。而螯虾对照组(1b)，罗氏沼虾、日本沼虾、中华绒螯蟹、长江华溪蟹均无杂交信号。

图1斑点杂交检测WSSV感染72 h后的淡水虾蟹

1a 螯虾感染组，1×剂量；1b 螯虾对照组；1c 以发病螯虾为毒源进行螯虾第2次感染；2a-c 依次罗氏沼虾、日本沼虾、中华绒螯蟹感染组；3a 长江华溪蟹；3b 唐海典型病虾；3c 健康对虾对照。

Fig.1Detection of freshwater prawn and crab after 72 h infection with WSSV

(1a:Crayfish Cambarus clarkii infection group 1×dose; 1b:Crayfish control; 1c: Repeat the infection of crayfish;2a-c: Corresponding: Macrobrachium rosenbergii、Macrobrachium nipponensis、Eriochier sinensis, Sinopotamon yangtsekiense; 3b: Shrimp from Tanghai typically infected with WSSV; 3c: Healthy shrimp control.

2.2淡水螯虾人工感染结果如图2所示。实验组(1～3组)感染至12 d,死亡率分别为82%、100%、100%；而对照组死亡率为9%，死亡个体经电镜检测未见病毒粒子，Dot-blot及原位杂交结果呈阴性反应。

图2淡水克氏螯虾感染WSSV后积累死亡曲线 (水温19 ℃)

1组：3×剂量；2组： 2×剂量；3组：1×剂量；4组：对照组

Fig.2Acumulative death curve of Cambarus clarkii infected with WSSV (Water temperature 19 ℃)

Group 1: 3×dose; Group 2: 2×dose; Group 3: 1×dose; Group 4: Control

从图1结果可看出感染剂量大小与螯虾死亡率呈正相关。克氏螯虾感染WSSV<